بررسی تغییرات بیان ژن‌های IL-1β،IL-6 ، BCL2، TNF-αدر موش‌های صحرایی نر مبتلا به سنگ کلیه تحت تیمار عصاره آبی گل کاسنی(Cichorium intybus L.)

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زیست شناسی، واحد دامغان، دانشگاه آزاد اسلامی، دامغان، ایران.

2 دانشیار، دکترای تخصصی فیزیولوژی جانوری، گروه زیست شناسی، واحد مشهد، دانشگاه آزاد اسلامی، مشهد، ایران.

3 گروه میکروبیولوژی، واحد کرج، دانشگاه آزاد اسلامی، البرز، ایران.

4 گروه زیست شناسی، واحد مشهد، دانشگاه آزاد اسلامی، مشهد، ایران.

چکیده

زمینه و هدف: سایتوکین های IL-1β ،IL-6 ،  TNF-α باعث پاسخ التهابی و عفونت، و در نهایت افزایش تخریب سلول(کاهش بیان پروتئین آنتی آپوپتوز BCL2 ) در بافت آسیب دیده می شوند. در این مطالعه هدف بررسی اثر عصاره آبی گل کاسنی را بر بیان ژن های مربوطه است.
روش کار: در این مطالعه 24 سر موش صحرایی نر نژاد ویستار در چهار گروه 6 تایی: کنترل سالم، گروه دریافت کننده اتیلن گلیکول، گروه های پیشگیری با دوزهای mg/kg 200 و mg/kg 50که تزریق داخل صفاقی عصاره آبی گل کاسنی را به همراه 1 % اتیلن گلیکول برای القاء تشکیل بلورهای کلسیم، از روز اول آزمایش و به مدت 30 روز دریافت کردند. استخراج  RNA از بافت کلیه انجام شد و cDNA سنتز شد. توسط تکنیک Real time PCR، سطح بیان IL-1β،IL-6 ، BCL2،  TNF-αمورد بررسی قرار گرفت.
یافته ها: آنالیز داده ها به کمک آزمون واریانسیک طرفه(ANOVA)، تستTukey  و نرم افزار SPSS نشان داد که درگروه­های پیشگیری: بیان ژن  BCL2 افزایش و TNF-α کاهش معنی دار یافت(001/0>P). هم­چنین افزایش معنی دار(001/0>P) بیان ژن های  IL-6(درگروه های پیشگیری با دوز 50 ) و  IL-1β(درگروه های پیشگیری با دوز 200 ) مشاهده شد.
نتیجه گیری: عصاره گل کاسنی در رفع اثرات نکروزی ناشی از TNF-α و به تبع کاهش آپوپتوز سلول های اپی تلیالکلیوی موثر است، اما بر IL-6 و به ویژه رفع عفونت ناشی از IL-1β تاثیر ندارد.

کلیدواژه‌ها


مقدمه

 

تعامل بین کلسیم و اگزالات در دستگاه گوارش در شکل گیری سنگ کلیه اگزالات کلسیم تأثیرگذار است(21). کلیه ها مسیر اصلی دفع و تنها محل شناخته شده عملکرد اگزالات هستند. قرار گرفتن سلول های اپی تلیال کلیوی در معرض اگزالات باعث آسیب اکسیداتیو می شود(23). استرس اکسیداتیو ناشی از کریستال های اگزالات کلسیم و بار بالای اگزالات، منجر به التهابات میان بافتی می شود که می تواند با افزایش بیان سیتوکین های مختلف مولد التهاب مشخص شود(11). سایتوکاین­های پیش التهابی عمده TNF-α، IL-1ß، IL-6 هستند(6). بررسی‌ها نشان دادند ترشح سایتوکین‌ها با آزاد شدن هورمون های استرس مرتبط می­باشند و یک عامل استرس زا باعث القا سنتز سایتوکاین­های پیش التهابی مانندTNF-α  و  IL-6 در بدن می شود(5). در جریان التهاب نیز،TNF-α  ترشح می شود که باعث تشدید پاسخ ایمنی می گردد(2). فاکتور TNF-α هم­چنین از طریق افزایش فعالیت سوپراکسید، کاهش نیتریک اکسید اندوتلیالی منجر به کاهش فیلتراسیون گلومرول شده و اثرات مستقیمی بر بازجذب سدیم توبولی دارد(4).  TNF-αاز سایتوکاین­های مهم سیستم ایمنی می باشد که در تحریک پاسخ های ایمنی نقش دارد و این سایتوکین از سلول های مختلف ایمنی از جمله ماکروفاژها و مونوسیت های فعال ترشح می­شود. این سایتوکین هم­چنین می تواند سبب القاء مرگ برنامه ریزی شده(آپوپتوز) در سلول­های هدف گردد(1).آپوپتوز که به مرگ سلولی برنامه ریزی شده شهرت دارد، بر اثر بر هم­کنش پروتئین های خانواده  BCL2 که شامل پروتئین آنتی اپوپتوتیک BCL2 و پروتئین پرو اپوپتوتیک Bax است ایجاد می شود(7). پروتئین‌های پروآپوپتیک(Bax) از سیتوپلاسم به جدار میتوکندری تغییر مکان داده و سبب نفوذپذیری جدار خارجی میتوکندری می شود که خود منجر به آزاد شدن سیتوکروم c و شروع آپوپتوز می شود بر خلاف عملکرد پروتئین Bax، پروتئین آنتی‌آپوپتوز BCL2 از پارگی جدار میتوکندری جلوگیری می کند(27، 7). IL-1β نیز در پاسخ التهابی در برابر عفونت نقش مهمی بازی می­کند(9) و باعث یک پاسخ التهابی عمومی از جمله اعزام نوتروفیل ها و ماکروفاژها به محل تشکیل کریستال­های کلسیمی در توبول های ادراری نیز می شوند(25). در رابطه با IL-6 باید گفت اینترلوکین 6 سایتوکاینی است که نه تنها در پاسخ التهابی و عفونت دخیل است بلکه سوخت و ساز بدن، احیا و فرآیندهای عصبی را تنظیم می­کند. بنابراین IL-6 در هردو نقش متضاد ضد التهابی و پیش التهابی را ایفا می کند اما عمدتاً نقش پیش التهابی دارد(10). هم­چنین در مطالعات قبلی ثابت شده که پلی­مورفیسم محرک عملکرد IL-6 یعنی پلی مرفیسم تک نوکلئوتیدی(SNPs) که بر بیان سطح IL-6 تاثیر می­گذارد، در ارتباط با عملکرد کلیه و شیوع بیماری مزمن کلیه می باشد(26). تولید بیش از حد گونه نیتروژن واکنشی در نتیجه افزایش بیان ژن های واسطه گر پیش التهابی، پراکسیداسیون لیپیدی غشاء سلولی و آسیب­های اکسیداتیو DNA همراه با تولید متابولیت های سمی باعث مرگ برنامه ریزی شده سلول می شود(8). بنابر این افزایش سایتوکین های التهابی و آسیب های اکسیداتیو DNA در بیماری های مرتبط با کلیه شایع است(30). مکمل های آنتی اکسیدان حفاظت سلولی را در کلیه با مهار بیان بیش از حد سایتوکین های التهابی فراهم می­کنند(12). در این راستا نیز وجود آنتوسیانین ها در گل­های کاسنی(c.intybus) گزارش شده اند(24). علاوه بر این برخی ترکیبات کاسنی مانند ساپونین ها، ترکیبات پلی فنولیک، فلاونوئیدها و اسیدهای پلی فنولیک(11)، سیکوریک اسید(20)، ß-سیتواسترول(16) خاصیت ضد التهابی دارند. به طوری که یکی از مهم­ترین ترکیبات آنتی اکسیدان در کاسنی فلاونوئیدها و اسیدهای فنولیک هستند که دارای فعالیت آنتی اکسیدانی هستند که با توجه به حضور گروه های هیدروکسیل در ساختار رادیکال های آزاد خود، به عنوان سیستم دفاعی در برابر آسیب های اکسیداتیو به دلیل عمل می کنند. فنول و یا پلی فنول ها موجود در کاسنی نشان داده شده است که دارای سطوح بالایی از فعالیت های آنتی اکسیدانی هستند که مکانیسم عمل  این ترکیبات آنتی اکسیدانی، به خنثی کردن رادیکال های آزاد و جلوگیری از تجزیه هیدرو پراکسیدها توسط رادیکال های آزاد بر می گردد(20، 11). از طرفی فلاونوئیدها دارای اثرات ضد التهابی نیز می باشند(3). در مقالات مختلف نیز خاصیت ضد التهابی کاسنی مکرر اشاره و ثایت شده است(31، 19). به طور مثال در مطالعه ای که بر روی سلول های سرطان روده بزرگ در انسان صورت گرفت، مشخص شد که عصاره کاسنی موجب مهار TNF-α از طریق سرکوب بیان سیکلواکسیژناز=2(COX-2) می شود(16). هم­چنین TNF-α و IL-1β موجب افزایش بیان ICAM-1(مولکول عامل چسبندگی داخل سلولی -1) و VCAM-1 (مولکول چسبنده سلول­های عروقی-1) در سلول های اپی­تلیال تنفسی می شوند و ائوزینوفیل ها میزان چسبندگی به این سلول­ها را پس از تحریک افزایش می دهند(28)، طوری که در مطالعه ای که بر میزان بیان این سایتوکین ها در سوختگی و التهابات ناشی از سوختگی انجام شده مشخص شد که التهاب نیز نقش مهمی در پیشرفت آسیب های کلیوی ناشی از سوختگی­های شدید دارد. سیتوکین­های پیش التهابی مانند TNF-α، IL-1β و IL-6، و مولکول چسبندگی سلول: ICAM-1 می توانند واکنش­های التهابی قوی در پاسخ به محرک مضر را آغاز کنند. در موش هایی با شدت سوختگی، سطح بیان mRNA مربوط به TNF-α، IL-1β و ICAM-1 در بافت کلیه با افزایش معنی دار همراه بوده است(32). بنابراین با استناد به مطالعات قبلی در رابطه با تاثیر کاسنی بر تخفیف التهاب و عفونت ناشی از افزایش سایتوکین­های التهاب زا مانند TNF-α، و اثبات اثر ضد التهابی ترکیبات آنالیز شده حاصل از عصاره کاسنی، که قاعدتاً اثر مستقیم این ترکیبات را در کاهش بیان ژن های TNF-α، IL-1β و IL-6 یا افزایش بیان پروتئین ضد آپوپتوز BCL2 اثبات می کند، بر آن شد تا اثر عصاره آبی گل کاسنی را بر میزان بیان ژن سایتوکین های پیش التهابی IL-1β،IL-6 ،  TNF-αو پروتئین BCL2 و اثرات ناشی از این سایتوکین ها بر سلول های اپی­تلیال کلیوی مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روش ها

نمونه گل کاسنی(Cichorium intybus L.) از روستای اسدآباد نیشابور جمع آوری شده و بعد از شناسایی توسط متخصصین گیاه شناسی پژوهشکده علوم گیاهی دانشگاه فردوسی مشهد به شرح زیر شناسایی و در هرباریوم کد گذاری شده است:

Cichorium intybus L.

Family: Asteraceae (Compositae)

Voucher sp. no. : 38201(FUMH)

روش عصاره گیری

ابتدا گل های کاسنی در سایه خشک و تا زمان عصاره گیری در محیط خنک نگهداری شدند و در آسیاب برقی کاملاً پودر شده سپس 100 گرم از پودر در 1000 میلی لیترآب شد و به مدت 72 ساعت در آون در دمای 35 درجه سانتی گراد قرار داده شد. محلول حاصل نیز با پمب خلاء و قیف بوخنر صاف شد و پس از حذف ناخالصی در دمای 35 درجه سانتی گراد در آون خشک شد. از پودر خشک شده برای تهیه دوز‌های50 و 200 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن موش استفاده شد این عصاره روزانه به صورت تازه تهیه و در اختیار حیوانات قرار داده شد(17، 15، 14).

تیمار حیوانات

تعداد 24 سر موش صحرایی نر نژاد ویستار (wistar) با سن یکسان و میانگین وزنی10 ±250 گرم به طور تصادفی به 4 گروه 6 تایی: گروه کنترل سالم، گروه دریافت کننده اتیلن گلیکول(EG) ، گروه پیشگیری با دوز پایین(50 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن عصاره آبی گل کاسنی) و گروه پیشگیری با دوز بالا(200 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن عصار آبی گل کاسنی) تقسیم شدند(15). از این حیث که سیستم بدنی موش مشابه با سیستم بدن انسان می باشد، رت های نژاد ویستار را جهت آزمایش فوق در نظر گرفته شد. موش ها در اتاق حیوانات با درجه حرارت 2±23 درجه سانتی گراد و دوره نوری 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی نگهداری گردیدند. حیوانات ضمن دسترسی آزادانه به آب و غذا در مدت30 روز به صورت زیر تیمار شدند: به آب آشامیدنی تمام گروه ها به جز گروه کنترل سالم، 1% اتیلن گلیکول(18) در مدت 30 روز اضافه شد. هم­چنین در گروه کنترل سالم و گروه اتیلن گلیکول 1% آب مقطر به صورت درون صفاقی از روز اول تیمار به مدت 30 روز، تزریق گردید. گروه های پیشگیری با دوزهای mg/kg 200 و mg/kg 50 وزن بدن عصاره آبی گل کاسنی را در مدت 30  روز به صورت تزریق درون صفاقی دریافت کردند(18، 13). این مطالعه بر اساس مصوبه کمیته اخلاقی دانشگاه آزاد و مطابق اعلامیه هلسینکی انجام شد.

استخراج RNA، سنتزcDNA و سنجش بیان ژن ها به روش Real time PCR:

تیمار با اتیلن گلیکول با دوز مصرفی 1%(18) در گروه های کنترل منفی و پیشگیری، موجب التهاب و آسیب کلیه در این گروه ها می شود، در نتیجه سطح بیان ژن های مورد مطالعه تمامی نمونه ها در گروه کنترل سالم و گروه پیشگیری با گروه کنترل منفی مقایسه می­شود. بنابراین در طی مراحل آزمایش از بافت کلیه تمامی نمونه ها، نمونه برداری صورت گرفت. سپس مراحل استخراج RNA با استفاده از کیت استخراج RNA  و طبق پروتکل شرکت دنا زیست - آسیا به روش ستونی انجام شد. با استفاده از تکنیک اسپکتروفتومتری نانو دراپ از کمیت RNA استخراج شده و استخراج صحیح آن اطمینان حاصل شد. دستگاه به طور اتوماتیک غلظت RNA را با استفاده از جذب نوری در طول موج 260 نانومتر، محاسبه و دستگاه غلظت نمونه مورد نظر را در طول موج مربوطه، بر حسب میکروگرم بر میکرولیتر، محاسبه می کند. بنابراین جهت کنترل کمیت یا غلظت RNA، نانودراپ انجام شد. هم­چنین جهت اطمینان از کنترل کیفیت مقدار RNA استخراج شده RNA بر روی ژل آگارز 5/1 درصد قرار داده و طبق دستوالعمل کیت سنتز cDNA(شرکت پارس توس)، تقریباً 5 میکروگرم از هر یک از نمونه های RNA برداشته و cDNA سنتز شد. توالی نوکلئوتیدی پرایمر Forward و توالی نوکلئوتیدی پرایمر Revers مکمل ژن های IL-1β،IL-6 ، BCL2، TNF-αدر رت از طریق نرم افزار الیگو 7(سایت NCBI) مورد بررسی قرار گرفت تا از اختصاصی بودن محل جفت شدن پرایمرها اطمینان حاصل شود، مطابق جدول 1 در انتها تکنیک Real time PCR با استفاده از پرایمر اختصاصی ژن های IL-1β،IL-6 ، BCL2، TNF-α و ژن GAPDH که به عنوان House keeping استفاده شد، و طبق پروتکل پیشنهادی کیت شرکت پارس توس انجام پذیرفت. واکنش Real time PCR برای تکثیر ژن های IL-1β،IL-6 ، BCL2،  TNF-α طبق پروتکل با 10 میکرولیتر سایبرگرین، 1 میکرولیتر Template cDNA، 7/7 میکرولیتر آب مقطر و پرایمر اختصاصی در دمای 63 درجه سانتی­گراد انجام شد. مرحله تکثیر شامل یک مرحله واسرشت شدن ابتدایی دردمای 95 درجه سانتی­گراد به مدت 20 ثانیه، باز شدن رشته الگو در دمای95درجه سانتی­گراد  به مدت 15 ثانیه، اتصال پرایمر به الگو و تکثیر قطعه مورد نظر در دمای 61 درجه سانتی­گراد به مدت 30 ثانیه و در پایان یک مرحله انتهایی در دمای 72 درجه سانتی­گراد به مدت 5 دقیقه بود.

نتایج

اثر عصاره آبی گل کاسنی(Cichorium intybus L.) بر تغییر بیان ژن های IL-1β،IL-6 ، BCL2، TNF-α در بافت کلیه موش صحرایی نر مورد بررسی قرار گرفت. در جدول2، اختلاف معنی دار بین گروه ها با سطح معنی داری(05/0>P) در نظر گرفته شده است.

TNF-α، درگروه های پیشگیری با دوز پایین(50 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن) و پیشگیری با دوز بالا (200 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن) نسبت به گروه دریافت کننده اتیلن گلیکول کاهش معنی داری(001/0>P) یافته است(جدول 2). افزایش بیان ژن BCL2 نیز درگروه پیشگیری با دوز پایین (50 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن) و در گروه پیشگیری با دوز بالا (200 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن) نسبت به گروه دریافت کننده اتیلن گلیکول معنی دار (001/0>P) می­باشد(جدول2 ). کاهش بیان ژن IL-6 درگروه پیشگیری با دوز بالا(200 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن) معنی دار نیست و تقریباً تفاوتی با گروه اتیلن گلیکول ندارد اما در دوز 50 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن میزان بیان ژن IL-6 افزایش معنی داری(001/0>P) را نشان می دهد(جدول2). افزایش بیان ژن IL-1β درگروه­های پیشگیری با دوز پایین(50 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن)، پیشگیری با دوز بالا(200: 001/0>P) نسبت به گروه دریافت کننده اتیلن گلیکول مشاهده می شود(جدول2). نمودار های 1، 2، 3، 4 مربوطه تکثیر ژن های مربوطه و تصویر ژل الکتروفورز ( شکل1) مربوط به استخراج RNA می باشد.

 

 

جدول1-توالی پرایمر مورد استفاده برای بررسی بیان ژن های GAPDH، IL-1β،IL-6 ، BCL2، TNF-α

TM

Primer Sequence

 

GENES

60°c

60°C

5´-TGCTGGTGCTGAGTATGTCG -3´

5´-GCATGTCAGATCCACAACGG -3''

Forward:

Reverse:

GAPDH

56.3°C

57.6°C

5´-GGTGATCGGTCCCAACAAGGA - 3´

5´-CACGCTGGCACAGCCACTC -3´

Forward:

Reverse:

 

TNF-α

 

52.4°C

53.8°C

5´-CTCCATGAGCTTTGTACAAGG- 3´

5´-TGCTGATGTACCAGTTGGGG- 3´

Forward:

Reverse:

IL-1β

55.9°C

49.7°C

5´-CACGGCCTTCCCTACTTCAC- 3´

5´-TGCAAGTGCATCATCGTTGT- 3´

Forward:

Reverse:

IL-6

48.0°C

48.9°C

5´-CATGCGACCTCTGTTTGA- 3´

5´-GTTTCATGGTCCATCCTTG- 3´

Forward:

Reverse:

BCL2

 

 

 

 

شکل 1- ژل الکتروفورز و ترتیب گروه ها، 1: گروه کنترل سالم،  2 : گروه اتیلن گلیکول (%1)، 3 : اتیل گلیکول %1+ دوز50 گل کاسنی، 4 : گروه اتیل گلیکول  %1+ دوز 200 گل کاسنی

 

 

 

نمودار های 1 و2- تکثیر ژن های BCL2 و TNF-α (به ترتیب از راست به چپ) در واکنش Real time PCR 

 

 

نمودار های 3 و 4 - تکثیر ژن های IL-6 و IL-1β(به ترتیب از راست به چپ) در واکنش Real time PCR

 

جدول 2- توالی پرایمر مورد استفاده برای بررسی بیان ژن هایIL-1β ،IL-6 ،BCL2 ، TNF-α

ژن ها

کنترل سالم

اتیلن گلیکول (%1)

اتیلن گلیکول %1+ دوز50 گل

اتیلن گلیکول %1+ دوز 200 گل

P

TNF-α

0±1

01/0±06/1

03/0±47/0***

02/0±11/0***

001/0>P

BCL2

0±1

003/0±05/1

02/0±39/1**

05/0±75/1***

001/0>P

IL-1β

0±1

005/0±26/0##

02/0±79/0

02/0±1/1***

001/0>P

IL-6

0±1

02/0±99/0

27/0±77/3***

08/0±81/0

001/0>P

# مقایسه بین گروه اتیلن گلیکول با گروه کنترل سالم و* بین گروه اتیلن گلیکول با گروه پیشگیری با دوز mg/kg 200 و mg/kg 50 را نشان می دهد. سطح معنی داری در سطح(#  و *) 05/0>P، (##  و **)  01/0> P، (###  و ***) 001/0>P در نظر گرفته شده است.


بحث و نتیجه گیری

این مطالعه بدین منظور طراحی گردید تا میزان بیان سایتوکین های پیش التهابیIL-1β، IL-6، TNF-α(32) و آنکوژن آنتی آپوپتوز BCL2(22) را در بافت کلیه موش های صحرایی نر تیمارشده با اتیلن گلیکول پس از دریافت عصاره آبی گل کاسنی مورد بررسی قرار دهد. با توجه به این که در تیمار با عصاره آبی گل کاسنی موجب افزایش معنی دارIL-6  در دوز mg/kg 50 وزن بدن و در دوز mg/kg 200 IL-6 باعث کاهش اما تفاوت معناداری با گروه اتیلن گلیکول ندارد شده در مجموع به نظر می رسد گل کاسنی اثر قابل توجهی بر بیانIL-6 (در دوز mg/kg 200) نداشته باشد. با استناد به این­کهIL-6  موجب اختلال در عملکرد کلیه و شیوع بیماری مزمن کلیه می شود(26)، به نظر می آید عصاره گل کاسنی نتوانسته بر التهابات ناشی از IL-6 در بافت کلیه فائق آید. در حالی که IL-1β نقش مهمی در پاسخ التهابی در برابر عفونت از طریق افزایش بیان عوامل چسبندگی اندوتلیال ایفا می کند در  نتیجه اجازه نفوذ لکوسیت در محل عفونت را می دهد(9). ممکن است IL-1β  یکی از عوامل بروز آسیب بافتی درتیمار با دوز mg/kg 200 گل کاسنی باشد که با افزایش دوز مصرفی گل کاسنی(001/0>P) در ایجاد عفونت ناشی از تهاجم لوکوسیت های آزاد کنندهIL-1β  دخالت دارد(جدول 2). زیرا بیانIL-1β  در دوز mg/kg 200 وزن بدن نسبت به دوز mg/kg 50 افزایش یافته است. اما در تحقیق حاضر کاهش بیان سایتوکین التهابی TNF-α و افزایش بیان آنکوژن آنتی آپوپتوز Bcl-2 قابل ملاحظه است(جدول 2). مرگ سلولی شامل آپوپتوز(BAX) و نکروز(TNF-α) است که در اثر آسیب  و مسمومیت بافت اتفاق می افتد(32). در یک بافت آسیب دیده، یکی یا هر دو می توانند عامل تخریب سلول شوند. پروتو آنکوژن های دخیل در آپوپتوز شامل BAX/ BAK/ FAS و آنتی آپوپتوز BCL-2/BCL-X1 می باشند(32). اتصال خارج سلولی TNF-α به گیرنده های سطح سلول موجب تنظیم بالادست پروتئین پیش آپوپتوز Bax و تنظیم پایین دست پروتئین ضد آپوپتوز Bcl-2 می شود و چون Bcl-2 به عنوان یک آنکوژن آنتی آپوپتوز(19) تلقی می شود که افزایش آن می تواند در مهار آپوپتوز سلولی ناشی از عوامل التهاب زا، عفونت زا و مخرب سلول، موثر باشد و با توجه به این که عصاره گل کاسنی توانسته در افزایش بیان Bcl-2 و کاهش بیانTNF-α  به طور معنی داری موثر باشد، احتمالاً TNF-α در تنظیم بیان Bcl-2 نقش موثری ایفا کرده است چرا که اثر عصاره گل کاسنی بر هر دو هم راستا می باشد. TNF-α یک سایتوکاین التهابی اولیه هست که افزایش بیان آن، احتمال آپوپتوز در سلول­های اپی تلیال را هشدار می­دهد و تصور می شود که نقش اصلی را در آسیب های کلیوی بازی می­کند. مسیر TNF-α در لوله­های ادراری از طریق مسیر گیرنده مرگ سلولی و القاء آپوپتوز و تولیدگونه­های اکسیژن واکنشی می­باشد(22). اگرچه ارتباط بین گونه های اکسیژن واکنشی و آپوپتوز توبول های ادراری روشن به نظر می رسد، اما در مورد ژن های درگیر در القا کننده آپوپتوز یا تولید گونه های اکسیژن واکنشی اطلاعات کمی وجود دارد(29). اما با این حال استرس اکسیداتیو نقش اصلی را در پیشرفت آسیب های شدید کلیه بازی می کند. به طوری که گونه های اکسیژن واکنشی(ROS) یک فاکتور اصلی جهت آزاد شدن سایتو کین های دخیل در آسیب بافت کلیه هستند که منجر به پراکسیداسیون لیپیدی، اکسیداسیون پروتئین، آسیب DNA، کاهش آنزیم های آنتی اکسیدان و سرانجام مرگ سلول و آسیب کلیه می شوند. تخمین زده شده که سایتوکین­های پیش التهابی مانند TNF-α، IL-1β، IL-6، ICAM-1 (مولکول عامل چسبندگی داخل سلولی -1) و کاسپاز-3 می توانند به شدت واکنش های التهاب زا را در پاسخ به تحریکات ناشی از آسیب بافت کلیه القا کنند(32). بنابراین مکانیسم ذکر شده فقط می­تواند در مورد TNF-α و Bcl-2 قابل توجیه باشد و کاهش بیان معنی دار TNF-α و افزایش بیان Bcl-2 در تیمار با عصاره گل کاسنی، از طریق مکانیسم فوق(بررسی آنزیم های آنتی اکسیدان، سنجش گونه های اکسیژن واکنشی و کاسپاز-3) قابل بررسی می باشد. چرا که با افزایش IL-1β به ویژه در دوز mg/kg  200( 001/0>P) و در مورد IL-6 افزایش بیان در دوز mg/kg 50 مشاهده می­گردد(جدول 2). در این مطالعه، دلیل تفاوت در بیان سایتوکین ها مشخص نیست ولی ممکن است الگوهای متفاوت در سطح سلولی برای تولید سایتوکین ها و به تبع نفوذ لوکوسیت ها در سلول های پارانشیمال کلیه وجود داشته باشد. عصاره آبی گل موجب افزایش بیانIL-1β (در دوز 200 : 001/0>P) و IL-6(در دوز 50 : 001/0>P) شده و نتوانسته اثرات ناشی التهاب و عفونت این سایتوکین ها در کلیه تخفبف دهد. اما احتمالاً ترکیبات آنتی اکسیدان ذکر شده در گل، توانسته به واسطه افزایش آنزیم های آنتی اکسیدان و کاهش رادیکال آزاد، کاسپازها و... در افزایش بیان پروتوانکوژن آنتی آپوپتوز Bcl-2(001/0>P) و کاهش بیان TNF-α(001/0>P) در کاهش تخریب سلولی در سلول های پارانشیمال توبول ادراری کلیه ناشی از مسمومیت با اتیلن گلیکول، موثر واقع شود.

تشکر و قدردانی

بدین وسیله از مساعدت و همراهی دانشگاه آزاد مشهد و دانشگاه علوم پزشکی مشهد به ویژه جناب آقای دکتر محمدیان، دکتر حسین آیت الهی و دکتر موسی الرضا حاج زاده تشکر و قدردانی می گردد.

-برادران قوامی، ش.، محبی، س ر.، اخوان سپه، ی ع.، ناقوسی، ح .، طاهایی، س م ا.، عظیم زاده، پ.، همکاران. 1392. بررسی پلی مورفیسم پروموتر ناحیه308-درتومور نکروز فاکتور((TNF- α دربیماران ایرانی مبتلاء به هپاتیتC مزمن. مجله علوم پزشکی دانشگاه آزاد اسلامی. سال بیست وسه. شماره 2. ص 93-99 .

2-ترتیبیان، ب.، پارسه، ر.، بقایی، ب .1394. پاسخ اینترلوکین6-، عامل نکروزآلفا وکورتیزول به فعالیت شدید ورزشی در زنان ورزشکار. مجله علوم پزشکی رازی. سال بیست و دو. شماره 133 . ص 1-7.

3-سعیدی، ج.، لطفی، م.، بزرگی، ه.، زنده دل، ا. 1390. بررسی اثرات پیشگیری کننده عصاره آبی گیاه جعفریPetroselinum sativum)) بر سنگ کلیه در موش­های نر نژاد ویستار. فصلنامه فیزیولوژی و تکوین جانوری دانشگاه آزاد اسلامی زنجان. پیاپی شانزدهم. شماره 4. ص 1-11.

4-حبیبیان، م.، پیری، م.، آذربایجانی، م.، هدایتی م .1391. اثر حمایتی تمرین هوازی در مقابل برخی از شاخص های پیش التهابی ناشی از مهار مزمن نیتریک اکسید سنتاز در بافت کلیه موش های صحرایی. مجله دانشگاه علوم پزشکی بابل. سال پانزدهم. شماره 1. ص30-37.

5- فرزانگی، پ.، محمدزاده، م.، آذربایجانی، م ع .1393. اثر تعاملی تمرینات ورزشی و مکمل بر سطوح استراحتی10 -IL و  TNF- αدر کاراته کاران. مجله پزشکی هرمزگان. سال شانزدهم. شماره 1. ص 27-36.

6-طاهری کلانی، ع ا .، ابراهیم، خ.، آذربایجانی، م ع. 1391. اثرتمرین استقامتی برسطوح سرمی سایتوکاین های پیش التهابی، تستوسترون وکورتیزول در مردان جوان غیرفعال. دوماهنامه علمی پژوهشی دانشگاه علومپزشکی کرمانشاه. سال شانزدهم. شماره 4 . ص 302-311.

7-نمازی، ن.، پازکی طرودی، ح.، داوودی، ح.، عجمی، م. 1391. بررسی نقش مسیرهای آپوپتوتیک وآنتی آپوپتوتیک در مسیر اثر اسیدهای چرب امگا 3 برآسیب ناشی از ایسکمی – رپرفیوژن در کلیه رت. مجله علوم تغذیه و صنایع غذایی ایران. سال هفتم. شماره 5. ص 531-537.

8.Ahmadiasl, N., Banaei, Sh., Alihemmati, AR.,Baradaran, B., Azimian, E. (2014). Anti-Inflammatory effect of erythropoietin and melatonin on renal ischemia reperfusion. injury in male rats. Advanced Pharmaceutical Bulletin, 4(1);49-54.

9.Alshehri, A., Elsayed, H. (2012). Molecular and biochemical evaluation of anti-proliferative effect of (Cichorium endivia, L.) phenolic extracts on breast cancer cell line: MCF7. J of Biotechnology and Pharmaceutical Research, 3(4); 74-82.

10. Chalaris, A., Scheller, J., Schmidt arras, D., Rose john, S. (2011). The pro-and anti-inflammatory properties of the cytokine interleukin-6. Biochimica Biophysica Acta, 1813; 878-888.

 

11.D. Shad, M.A., Nawaz, H., Rehman, T., Ikram, N. (2013). Determination of some biochemical, phytochemicals and antioxidant properties of different parts of cichorium intybus L. A comparative study. The Journal of Animal & Plant Sciences, 23(4);1060-1066.

12. Ganesh, R., Sridharan, B., Micheal, S., Ramachandran, A., Viswanathan, P. (2015). Citrus bioflavonoids ameliorate hyperoxaluria induced renal injury and calcium oxalate crystal deposition in wistar rats. Advanced Pharmaceutical Bulletin, 5(10); 1-9.

13. Ganbari Hadjzadeh, M.A.R., Khoei A.R., Hadjzadeh, Z., Parizady M.R. (2007). Ethanolic extract of Nigella sativa L. seeds on ethylene glycol-induced kidney calculi in rats. Endourology and Stone Disease, 4(2); 86-90. 

14. Ghaderi, S., Fatemi Tabatabaei, SR., Rashno, M., Askaripour M. (2016). The aqueous extract of Portulaca oleracea ameliorates neurobehavioral dysfunction and hyperglycemia related to streptozotocin-diabetes induced in ovariectomized rats. Iranian J of Pharmaceutical, 15(2); 561-571. 

15.Jamshidzadeh, A., Khoshnood, M.J., Dehghani, Z., Niknahad, H. (2006). Hepatoprotective Activity of Cichorium intybus L. Leaves extract against carbon tetrachloride induced toxicity. Iranian J of Pharmaceutical Research, 1; 41-46.

16.Katiyar, P., Kumar, A., Mishra, A.K. Dixit, R.K., Kumar, A., Kumar, R. (2015). Kasni (Cichorium intybus L.) a propitious traditional medicinal herb. International Journal of Pharmacognosy, 2(8); 368-380.

17.Khaksari, M., Rezvani, M.E., Sajadi, M.A., Soleimani, A. (2000). The effect of topically applied water extract of Rhazya stricta on cutaneous wound healing in rats. Koomesh, 1 (3); 1-10.

18.Khajavi Rad, A., Hajjizadeh, M.A.R., Rajaei, Z., Mohammadian, N., Valliollahi, S., Sonei, M. (2011). The beneficial effect of cyndon dactylon franctions on ethylene glycol-induced kidney calculi in rats. Endourology and Stone disease, 8(3); 179-184.

19.Koner, A., Ghosh, S., Roy, P. (2011). Isolation of antimicrobial compounds from chicory(Cichorium intybus L.) root. International Journal of Research in Pure and Applied Microbiology, 1(2); 13-18.

20.Khorshid Abbas, Z., Saggu, S.H., I Sakeran, M., Zidan, N., Rehman, H., Ansari, A. (2014). Phytochemical antioxidant and mineral composition of hydroalcoholic extract of chicory (Cichorium intybus L.) leaves. Saudi J of Biological Sciences, 2015(22); 322-326.

21.Lange, J.N., Wood, K.D., Mufarrij, P.W., Callahan, M.F., Easter, L., Knight, J. (2012). The impact of dietary calcium and oxalate ratios on stone risk. Urology, 79(6); 1226-1229. 

22.Li, W., Yan, M., Liu, Y., Liu, Z., Wang, Z., Chen, C. (2016). Ginsenoside Rg5 amelioraes cisplatin-induced nephrotoxicity in mice through inhibitionof inflammation, oxidative stress, and apoptosis. Nutrients, 8(566); 1-17.

23.Marengo, SR., Romani, AM. (2008). Oxalate in renal stone disease: the terminal metabolite that just won't go away. Nat Clin Pract Nephrol, 4(7); 368-77.

24.Mehmood, N., Zubair, M., Rizwan, K., Rasool, N., Shahid, M., Uddin, A.V. (2012). Antioxidant, antimicrobial and phytochemical analysis of Cichorium intybus seeds extract and various organic fractions. Iranian J of Pharmaceutical Research, 11(4); 1145-1155.  

25.Mulay, SR., Evan, A., Anders, H. (2013). Molecular mechanism of crystal_related kidney inflammation and injury.Implications for cholestrol embolsim, crystalline nephropathies and kidney stone disease. Nephrol Dial Transplant, 30; 1-8.

26.Okada, R., Wakai, K., Naito, M., Morita, E., Kawai, S., Hamajima, N. (2012). Proanti inflammatory polymorphisms and chronic kidney disease: a cross sectional study. BMC Nephrology, 13(2); 2-8.

27.Piltan, A., Totonchi, M., Rezazadeh, M., Gourabi, H., Karimian, L., Baghaban Eslaminejad, M. (2010). Quantitative expression of bag1, bax and bcl-2 genes in human embryos with different fragmentation gradesderived from ART. Yakhteh Medical Journal, 12(2); 257-266.

28.Thomas, P. (2001). Tumor necrosis factor-α: The role of this multifunctional cytokine in asthma. Immunology and Cell Biology, 79; 132-140.

29.Sheng, L-Ch., Lau, J. Godin, G., Maachi, N., Wu, H., Xin Zhu, J. (2012). Bcl-2–modifying factor induces renal proximal tubular cell apoptosis in diabetic mice. Original Article, 61; 474-484.

30.WenYing, G., Jin Guiz, L. (2012). Chicory seeds: a potential source of nutrition for Food and feed. J of Animal & Plant Sciences, 13(2); 1736-1746.

31.Zaman, R., Noorul Basar, S. (2013). A review article of beekhe kasni (Cichorium intybus) its traditional uses and pharmacological actions. Research Journal of Pharmaceutical Sciences, 2(8); 1-4.

32.Zhi Bai, X., He, H., GAO,  JX., Liu, Y., Qi Liu, J., Han, SCh. (2016). Melatonin prevents acute kidney injury in severely burned rats via the activation of sirtl. Scientific Reports, 6(32199); 1-13.