نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 گروه میکروب شناسی، دانشکده علوم، کشاورزی و فناوری‌های نوین، واحد شیراز، دانشگاه آزاد اسلامی، شیراز
2 گروه میکروبیولوژی دانشکده علوم پایه واحد زنجان، دانشگاه آزاد اسلامی، زنجان، ایران
3 مرکز تحقیقات نانوفناوری دارویی، گروه شیمی دارویی، دانشکده داروسازی،دانشگاه علوم پزشکی زنجان
4 گروه زیست شناسی، واحد گچساران، دانشگاه آزاد اسلامی، گچساران، ایران
5 گروه ایمونولوژی، انستیتوپاستور ایران، تهران، ایران.
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Inroduction & Objective: Klebsiella pneumoniae is the most common pathogenic bacterium in the genus Klebsiella. Every year, about 2 million children under the age of 5 die from pneumonia. Due to the acquired and inherent resistance of Klebsiella pneumoniae isolated against a wide range of antibiotics, its control and treatment appear to be critical. The aim of the present study was to use Polylactic-co-glycolic acid (PLGA) nanoparticles in vaccine design the LPS antigen of Klebsiella pneumoniae K2O1. So far, no work has been done on this strain of bacteria to make the PLGA-LPS vaccine. In the study, the results obtained from the tested mice showed that the mice were vaccinated. Immunized and titrated antibodies of IgM 315 cfu / well, IgG 321 cfu / well, and SIgA 365 cfu / well, elevated and in mice with invasion factor in patients and spleen and lung tissues, number of people compared to unvaccinated mice Is. Has gone to zero.
Material and Method: In the present study, the LPS antigen was extracted from Klebsiella pneumoniae K2O1 by centrifugation and detoxified with phenol.Then the LPS antigen was conjugated to polylactic-co-glycolic acid nanoparticles. Infrared spectroscopy (FT-IR) and atomic force microscopy (AFM) were used to confirm conjugation with nanoparticles. To evaluate endotoxin of the vaccine designed Tested by Limolus amoebocyte lysate assay (LAL test). success of antigen and nanoparticles conjugates based on the size and charge of antigen-containing nanoparticles was confirmed by the zetasizer.
Results: FT-IR results the shape of the corresponding peaks confirmed the presence of antigen-functional groups in the nanoparticle structure and the formation of bonds. AFM microscopic images of nanoparticles containing LPS antigen and nanoparticles before conjugation showed an increase in the binding sites of nanoparticles after conjugated. Change from initial sharpness to puffiness after conjugation proved the success of antigen transport by nanoparticles. Fever was not observed in rabbits and mortality was confirmed in BALB/C mice.
Conclusion: The results showed that the vaccine was effective in immunogenicity and therefore suggested as a candidate for an effective vaccine against Klebsiella pneumoniae.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه
کلبسیلاپنومونیه یک باکتری گرم منفی، بی‌هوازی اختیاری، غیر متحرک، لاکتوز مثبت، میله‌ای کپسول دار می‌باشد(8). برای مطالعه عوامل باکتریولوژیک مرتبط با بیماری دستگاه تنفسی تحتانی ناشی از کلبسیلاپنومونیه به دلیل قیمت پایین و سهولت نگهداری از جوندگان کوچک آن ها را به حیواناتی جذاب برای این نوع مطالعات تبدیل کرده است. مطالعات گذشته حاکی از این مورد است که تلقیح داخل بینی کلبسیلا پنومونیه به داخل بینی جوندگان باعث پنومونی می شود(12).استفاده از واکسن برای مقابله با عفونت های ویروسی تاریخی طولانی دارد اما مطالعه در مورد ساخت واکسن بر علیه کلبسیلاپنومونیه چندان قدمتی ندارد تلاش های زیادی برای ساخت واکسن در دنیا بر علیه این باکتری انجام شده ولی نتایج رضایت بخشی مشاهده نشده است(7). استفاده از اپی‌توپ های مختلف باکتری برای تولید واکسنی کارا مورد مطالعه قرار گرفته و هم چنان مطالعات مختلفی برای شناسایی قسمتی از باکتری که واکسنی کارا بشود از آن برای تولید واکسن استفاده کرد ه ادامه دارد(20). استفاده از لیپوپلی ساکارید(LPS) در زمینه تولید واکسن بر علیه کلبسیلا پنومونیه مورد مطالعه قرار نگرفته است. لیپوپلی‌ساکارید LPS از سه قسمت تشکیل‌شده است. 1- بخش بسیار حفاظت‌شده و آب‌گریز لیپید A که به غشای خارجی لنگرانداخته است. 2- بخش بسیار متغیر آنتی‌ژن O و خارجی‌ترین بخش LPS و 3- بخش مرکزی پلی‌ساکاریدی متصل به لیپید A و آنتی‌ژن O. بخش آنتی‌ژن O دارای 9 گروه آنتی‌ژنی تا به امروز شناسایی‌شده است(16,31). آنتی‌ژن O1 در اکثر گروه‌های بیماری‌زا جداسازی شده و در بدن میزبان مانع از فعال‌سازی ترکیبات کمپلمان و به‌واسطه‌ی این عمل از کشته شدن به‌واسطه‌ی مسیر کمپلمان جلوگیری می‌کند(16,27). لیپید A موجود در LPS توسط آنزیم‌های موجود در سیتوپلاسم سنتز و توسط سیستم ABC منتقل می‌شود(9). لیپید A یا اندوتوکسین خاصیت سمی داشته و روی مونوسیت‌ها و ماکروفاژها اثر می‌گذارد. این توکسین موجب آزادسازی TNF، اینترلوکین‌ها و فاکتور محرک کلنی می گردد(1). دیواره‌ی باکتری‌های گرم منفی از LPS تشکیل‌شده که در ارتباط با بیماری‌زایی باکتری می‌باشد(13). لیپید اولیه‌ی سطح باکتری‌های گرم منفی و اصلی‌ترین جزء دیواره‌ی آن‌ها بوده و نام دیگر آن اندوتوکسین است و در ارتباط با بیماری‌های مجاری ادراری می باشد. بخش لیپید A در میان تمامی باکتری‌های گرم منفی یکسان است بخش مرکزی O نیز در میان باکتری‌های گرم منفی مشابه بوده و از نواحی هپتوزی(هفت کربنه) تشکیل‌شده است. بخش بیرونی ناحیه O به‌عنوان آنتی‌ژن تلقی می‌شود و از یک یا چند واحد الیگوساکاریدی متغیر تشکیل‌شده که در سروتایپ‌های مختلف متفاوت است(8،31). LPS قادر به تحریک سلول‌های دندریتیک می‌باشند آنتی‌ژن O1 بیشترین بیماری‌زایی را در ایزوله‌ها نشان داده است در تحقیقاتی نشان داده که واکسن‌سازی علیه آنتی‌ژن O موجب ایمن‌سازی در برابر بسیاری از سروتایپ‌های کپسولی کلبسیلا می‌شود(2،9،16). آنتی‌ژنیک بودن LPS دلیلی برای تحریک سیستم ایمنی بدن و استفاده از آن در ساخت واکسن می‌باشد(20). نانو ذرات پلیمری پلی لاکتیک کو–گلایکولیک اسید(PLGA)، با توجه به مزایایی نظیر زیست تجزیه‌پذیری، دارا بودن تائیدیه FDA(سازمان غذا و داروی آمریکا) و EMA(آژانس پزشکی اروپا)، ازلحاظ ایمن بودن در کاربردهای انسانی، روش تهیه نسبتاً آسان، قابلیت تطبیق‌پذیری و کنترل آسان بسیار مورداستفاده قرار می‌گیرد(7). استفاده از PLGA کمترین سمیّت را در کاربردهای دارویی دارد. این پلیمرها تجاری و با جرم مولکولی و ترکیبات کوپلیمری مختلف هستند، زمان تخریب آن‌ها برحسب جرم مولکولی و کوپلیمریزاسیون بین چند ماه تا چند سال به طول می‌انجامد(24). نانو ذرات مزایای زیادی نسبت به میکرو ذرات دارند و جذب بالاتری در سلول‌ها به نسبت میکرو ذرات دارند. نحوه توزیع آن‌ها در بدن تحت تأثیر دو خاصیت فیزیکی و شیمیایی اندازه ذرات و بار سطحی ذرات می‌باشد. این فرمولاسیون در خون پایدار و غیرسمی می‌باشد و باعث لخته شدن خون نمی‌گردد(30). قابلیت هدف‌گیری نانو دارو با اندازه ذرات، بار سطحی، اصلاح سطح و آب‌گریزی، تحت تأثیر قرار می‌گیرد(18). از میان این موارد اندازه نانو ذرات و توزیع آن‌ها، برای تعیین برهمکنش آن‌ها با غشا سلولی و نفوذ آن‌ها از میان موانع فیزیولوژیکی حائز اهمیت‌اند. مکانیسم رهاسازی با وزن مولکولی پلیمرهای استفاده‌شده تغییر می‌کند. از دیگر خواص منحصر به‌فرد PLGA این است که معمولاً در چرخه‌های سلولی اختلالی ایجاد نمی‌کند و زمان قرارگیری دارو بر روی سلول و مسیر آندوسیتوزی را نیز کاهش می دهد که همین مسئله در بررسی های درمانی بسیار حائز اهمیت می‌باشد. دارو در مرکز PLGA قرار می‌گیرد و توسط لیگاندهای اتصالی PLGA می تواند در مولکول های هدف، به نوعی اتصال و انتشارتسهیل یافته ایجاد کند(30). این موضوع در ردیابی های خاص ضد توموری و در مبحث ایمونولوژی به‌عنوان پیشنهادی در جهت افزایش ورود آنتی‌ژن های میکروبی و در راستای اندوسیتوز آن توسط سلول‌های بیگانه خوار و افزایش تولید آنتی بادی های ضد آن و تولید واکسنی موثرتر مطرح می‌شود(7). سیستم واکسن رسانی مخاطی یکی از مسیرهای مهم و جای گزین به خاطر ایجاد هر دو پاسخ ایمنی سلولی و هومورال می باشد. استفاده از نانو ذرات به عنوان سیستم های نوین واکسن رسانی نه تنها باعث افزایش پایداری آنتی‌ژن و پاسخ ایمنی می شود بلکه باعث آزادسازی آهسته آنتی‌ژن و توانایی هدفمند کردن این سیستم به منظور ایجاد پاسخ ایمنی اختصاصی وجود دارد(3). هدف از تحقیق حاضر ارزیابی ایمنی‌زایی حاملین نانو ذرات PLGA حاوی آنتی‌ژن لیپوپلی‌ساکارید دتوکسیفای شده کلبسیلاپنومونیه K2O1 در مدل عفونت ریوی موش BALB/C است.
مواد و روش‌ها
باکتری کلبسیلاپنومونیه K2O1، ATCC10031 /PTCC1053 از مرکز منطقه ای کلکسیون قارچ ها و باکتری‌های صنعتی ایران در محیط مولر هینتون آگار خریداری و کشت انبوه در ارلن های 1 لیتری با حجم 250cc محیط کشت سنتیک صورت گرفت. ترکیبات محیط کشت: گلیسرول 10/1، دکستروز 5/0،L-گلوتامین 37/0، Na 2HPO4 06/0 ، 0/12K2HPO4 ،0 /13MgSO4 ، محلول یک نرمال NaOH ، محلول یک نرمال HCl؛ و گرماگذاری 35 واحد سلسیوس برای 7-5 روزو شیکر 100rmp ، سپس غیرفعال سازی باکتری با کمک فنل 90%، 0.05 سی سی) انجام شد(8). از بیومس جمع آوری شده کشت انبوه، سوسپانسیون میکروب در آب مقطر تهیه و تا 68 واحد سلسیوس تحت حرارت بن ماری قرارداده شد. سپس فنل 90 درصد به محلول فوق اضافه کرده و در حرارت بن ماری 68 سلسیوس به مدت 45 دقیقه قرار داده و بعد در آب یخ عمل سرد کردن سریع را انجام گردید. سپس در گرادیان 2000 به مدت 45 دقیقه سانتریفوژ و پس از جداسازی فاز آبی اتانول خالص برابر نصف حجم محلول اضافه و در همان گرادیان 2000 به مدت 45 دقیقه سانتریفوژ شد و محلول رویی جدا شده و سه برابر حجم محلول اتانول خالص اضافه گردید و بعد از سانتریفوژ رسوب LPS تهیه شد(2).LPS به دست آمده در حداقل محلول NaOH 2/0 حل گردید و به مدت 3 ساعت در بن ماری بادمای جوش قرار داده شد و pH با NaOH و HCl 1 نرمال در 7 تنظیم و با کیسه دیالیز 10 کیلو دالتون در برابر بافر آب مقطر با حداقل سه بار تعویض روزانه برای 2 روز دیالیز و سپس D-LPS با سه برابر اتانول خالص استخراج گردید(19). برای تهیه نانوذره های PLGA حاوی D-LPS ابتدا درون دو بالن ژوژه ی 100 میلی لیتری یک مگنت قرار داده شد و تقریباً 5 میلی لیتر از حلال DMF ریخته شد و سپس 200 میلی گرم PLGA به درون حلال اضافه شد.10 دقیقه برای حل شدن PLGA در حلال زمان داده شد. سپس EDC 200 میلی گرم و NHS 50 میلی گرم همزمان به داخل ظرف ریخته می‌شود و بعد از 5 دقیقه گذر زمان، آنتی‌ژن های کپسول و LPS جداگانه به مقدار 400 میلی گرم به داخل ظروف و بر روی بقیه مواد اضافه گردید و به مدت یک هفته در دمای آزمایشگاهی به منظور انجام واکنش استریفیکاسیون و تشکیل کونژوگه ی PLGA با لیپوپلی‌ساکارید وتشکیل این پیوند استری روی شیکر نگهداری شد. بعد از یک هفته فرمولاسیون آماده نگهداری در یخچال می‌گردد به منظور تخلیص و جداسازی ماکرومولکول کونژوگه بعد از انجام کونژوگاسیون ، با استفاده از ژل فیلتراسیون و سفادکس G-75 و بافر رقیق کننده PBS با سرعت 40 میلی لیتر در ساعت برقرار گردید وتا زمان عبور مایع ، معادل یک حجم بستر از ستون ادامه یافت. سپس با قرائت جذب فرکشن ها در طول موج 210 نانومتر، فرکشن های مربوطه جدا گردید(7). برای اندازه گیری سایز مولکول PLGA و فرمولاسیون LPS - PLGA از دستگاه Zetasizer ، میکروسکوپ الکترونی AFM و FT-IR برای اندازه گیری و شارژ مولکول PLGA، LPS-PLGA استفاده شد(3). ایمن‌سازی با آنتی‌ژن‌های تهیه شده با عمل واکسینه در موش BALB/C به‌صورت مخاطی انجام گردید. دوره واکسیناسیون شامل 3 دوز با فاصله دو هفته ای بود. هر گروه شامل 10 سر موش بود که 5 سر موش برای انجام عمل چالش قرار گرفت و 5 سر موش دیگر بعد از خون‌گیری و جداسازی سرم برای بررسی تیتر آنتی‌بادی و سنجش فعالیت اپسینوفاگوسیتوز مورداستفاده قرار گرفت(27). برای بررسی قدرت اپسینوفاگوسیتوزی آنتی بادی های القا شده(OPS) ابتدا سرم حیوانات ایمن شده رادر دمای 56 واحد سلسیوس به مدت 30 دقیقه غیرفعال شد در مرحله بعد سریال رقت در پلیت 96 خانه ای آماده گردید و با ساخت بافر هنکس که شامل یک درصد ژلاتین می‌باشد با باکتری کلبسیلاپنومونیه در 37 واحد سلسیوس و شیکر 220 انکوبه شد. سپس به محلول فوق کمپلمان بچه خرگوش اضافه گردید(با غلظت نهایی 5/12 درصد). و در مرحله اوپسینه شدن در دمای 37 واحد سلسیوس و شیکر rpm 220 به مدت 30 دقیقه انجام شد. حجم نهایی هر چاهک 40 میلی لیتر بود که با اضافه کردن ماکروفاژ تازه جداشده از موش ، به 80 میلی لیتر رسانده شد. سپس در مرحله بعد انکوبه 37 واحد سلسیوس با 250 rpm به مدت 45 دقیقه انجام گردید. در مرحله آخر رقیق سازی با محلول NaCl سرد 9% با حجم یکسان اضافه شد و از سوسپانسیون چاهک ها بر روی پلیت نوترینت آگار کشت داده شد وبعد از گرماگذاری در 37 واحد سلسیوس به مدت 48 ساعت تعداد کلونی باکتری‌های رشد کرده شمارش و محاسبه شدند(15). سنجش انفجارتنفسی NO نیتریک اکساید با افزودن 50 میلی لیتر محلول سولفانیلامید (2×25ml) به نمونه سرم و اضافه کردن 50 میلی لیتر محلول N-1-ناپتیلینیدیامین دی هیدروکلراید (2×25ml). به مدت 5 تا 10 دقیقه در دمای اتاق به دور از نور انکوبه نموده و توسط پیپت مولتی کانال ترکیب را داخل چاهک های میکروپلیت 96 خانه ای ریخته و توسط پیپت 1 میلی لیتر نیتریت استاندارد (1/0 نیتریت سدیم) اضافه شد و بادستگاه پلیت ریدر درمدت 30 دقیقه پیلیت هارا قرائت شد. بعدازاین زمان ممکن است رنگ بنفش محو شود ودیگررنگی دیده نشود(27). برای تعیین تیتر IgG و IgM و IgA علیه LPS از تست الیزا از نوع غیر مستقیم به روش تریپلیکیت استفاده شد. در ابتدا LPS را در بافر فسفات 1X با 3/7pH: با غلظت نهایی 2 میکروگرم بر میلی لیتر تهیه و به مقدار 200 میکرو لیتر به هر چاهک افزوده و پلیت به مدت یک شب در دمای 4 واحد سیلسیوس قرار داده شد. پلیت با بافر شستشو سه بار شستشو داده شد (هر بار 50 میکرو لیتر). محلول بلوکه کننده به مقدار 300 میکرو لیتر به چاهک ها افزوده و برای 60 دقیقه پلیت در دمای اتاق انکوبه شد و پلیت با بافر شستشوسه بار شستشو داده شد(هر بار 100 میکرو لیتر)(19). به چاهک های ردیف اول، 200 میکرو لیتر سرم رقیق شده در بافر PBS با رقت 1:10 اضافه کرده و به سایر چاهک ها 160 میکرو لیتر بافر PBS افزودیم. سپس از چاهک های ردیف اول 40 میکرولیتر به چاهکهای ردیف دوم افزوده و به همین ترتیب تا آخر ادامه داده ودر نهایت 40 میکرولیتر را دور ریختیم به این صورت رقت سازی به نسبت 1:5 انجام شد پس از انجام رقت سازی از همه چاهک ها 60 میکرولیتر را برداشته تا حجم سرم رقیق شده در هر چـاهک به 100 میکرولیتر رسید. سپس پلیت برای 2 ساعت در دمای اتاق انکوبه شد. پلیت با بافر شستشوسه بار شستشو داده شد (هر بار 100 میکرو لیتر). آنتی بادی Anti Mouse IgA کونژوگه با آنزیم هورس رادیش پراکسیداز با رقت 1:1000 در بافر PBS به مقدار 100 میکرو لیتر به چاهکها اضافه شد و پلیت برای 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه شد. آنتی بادی Anti Mouse IgG کونژوگه با آنزیم هورس رادیش پراکسیداز با رقت 1:1000 در بافر PBS به مقدار 100 میکرو لیتر به چاهکها اضافه شد و پلیت برای 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه شد. آنتی بادی Anti Mouse IgM کونژوگه با آنزیم هورس رادیش پراکسیداز با رقت 1:1000 در بافر PBS به مقدار 100 میکرو لیتر به چاهکها اضافه شد و پلیت برای 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه شد. پلیت با بافر شستشوسه بار شستشو داده شد(هر بار 100 میکرو لیتر). محلول سوبسترا به مقدار 100 میکرو لیتر به هر چاهک اضافه و پلیت برای 10 تا 15 دقیقه در 37 واحد سلسیوس انکوبه شد. به هر چاهک 50 میکرو لیتر محلول متوقف کننده اضافه شد. میزان جذب نوری پلیت در طول موج 450 نانومتر با دستگاه الایزا ریدر قرائت شد(28).چالش با سویه ی ویرولان از مسیر تنفسی در موش انجام یافت به این صورت که در ابتدا موش را با xylazine (mg kg-10 10) و کتامین (50 mg kg -1) بیهوش کرده و موش‌ها با دوز عفونی کننده باکتری از طریق اسپری ریوی آلوده شدند. بعد از سه الی پنج روز مواجه شدن موش‌ها با سویه بیماری‌زا بافت های ریه ، کبد ، طحال ازلحاظ وجود علایم عفونی و پاتولوژیک بررسی گردید. همچنین از بافت های مذکور بعد از هموژنیزه کردن در PBS pH:7.5 بر روی محیط نوترینت آگار کشت داده و شمارش کلونی ها بعداز گرما گذاری (سی و هفت درجه به مدت هفتاد و دو ساعت) انجام گرفت (31). برای بررسی و آنالیز آماری از نرم افزار SPSS ورژن 18 به روش واریانس یک طرفه ANOVA ONE WAY با آزمون آماری TUKEY با انحراف معیار P<0.05 بررسی و نتیجهگیری و گزارش گردید.
نتایج
نتایج استخراج آنتی‌ژن و بارگذاری در حامل نانو ذرات PLGA نشان داد که بعد از استخراج آنتی‌ژن لیپوپلی‌ساکارید کلبسیلاپنومونیه مطابق روشی که شرح داده شد محلول 1 میلی گرم برمیلی لیتر از آنتی‌ژن استخراج شده توسط دستگاه اسپکتروفتومتر UV-VIS مورد اندازه گیری قرارگرفته شده بودکه بیشترین جذب برای این آنتی‌ژن 270 nm = OD گزارش گردید. فرکشن های جمع آوری شده بعد از انجام ژل فیلتراسیون لوله های 98 و 99 در کونژوگه های PLGA -D-LPS وطول موج 270 نانومتر مربوط به آنتی‌ژن لیپوپلی‌ساکارید قرائت شد و لوله هایی که بیشترین جذب را در این طول موج داشتند به‌عنوان فرکشن های حاوی مولکول کونژوگه جمع آوری و با هم ادغام شدند. نتایج اندازه گیری سایز ذرات و شارژ نشان داد که پتانسیل زتای نانو ذرات PLGA برابر با mv 00/21- و کونژوگه PLGA-LPS برابر با d nm 7/18- و پتانسیل زتای آنتی‌ژن لیپوپلی‌ساکارید دتوکسیفیه شده mv2/26- بدست آمد (نمودارهای 1-2-3). طبق نمودار 4 اندازه نانو ذره PLGA،d nm 8/176 نانومتروسایز مولکول کونژوگه PLGA+LPS، d nm3/145 بدست آمد (نمودار 5). نتایج نمودار (1 الی 5) حاکی از آن است که مولکول کونژوگه علی رغم افزایش سایز نسبت به PLGA، باز هم در حد نانومتراست که موفقیت آمیز بودن بارگذاری آنتی‌ژن به نانو ذرات PLGA وحفظ سایز نانو را نشان می دهد. نتایج نمودار های به دست آمده از تست FT-IR گروه‌های PLGA، PLGA-LPS نشان داد، پیک‌های شاخص به ترتیب برای گراف پلی اتیلن گلیکولیک اسید PLGA جذب cm-1 41/3415 مربوط به مولکول های آب، جذب cm-1 07/2358 مربوط به کشش ارتعاشی گروه کربن واکسیژن C-O، جذب cm-1 95/1759 مربوط به گروه استری پلیمر پلی اتیلن گلیکولیک اسید، جذب cm-1 96/1626 مربوط به گروه کربونیل C=O، جذب cm-115/1388 مربوط به گروه CH3 متیل، جذب های cm-127/1187 و cm-1 47/1092 مربوط به CH گروه اتری می‌باشد.در پیک مربوط به آنتی‌ژن های لیپوپلی‌ساکارید LPS باکتری کلبسیلاپنومونیه K2O1 و نانو ذرات پلی اتیلن گلایکولیک اسید PLGA-LPS پیک‌های شاخص مشاهده شده به ترتیب، جذب cm-132/3459 مربوط به مولکول های آب، جذب cm-182/1758 مربوط به گروه استری که هم در ساختار نانوذره و هم در ساختار آنتی‌ژن می‌باشد، جذب cm-168/1575 مربوط به گروه کربونیل، جذب cm-11/1422 مربوط به گروه متیل آنتی‌ژن لیپوپلی‌ساکارید، جذب cm-1 69/1094 مربوط به پیوند اتری ʹR-O-R موجود در آنتی‌ژن لیپوپلی‌ساکارید و PLGA و جذب cm-1 03/650 مربوط به اکسپین ساختار فسفات PO4-3 می‌باشد. نتایج تصویربرداری AFM نیز نشان داد که تغییر شکل سایت‌های اتصالی قبل و بعد از انجام بارگذاری آنتی‌ژن LPS درنانوذرات PLGA جذب سطحی آنتی‌ژن را در سایت‌های اتصالی نانوذره تائید می نماید و گویای این مطلب است که اتصال با موفقیت انجام شده است. تغییر سایز سایت‌های اتصالی نانوذره PLGA از ارتفاع nm5/148 نانومتر قبل از کونژوگاسیون به ارتفاع nm7/179 نانومتر در PLGA-LPS و تغییر شکل سایت‌های اتصالی قبل و بعد از انجام این اتصال جذب سطحی آنتی‌ژن را در سایت‌های اتصالی نانوذره تائید می نماید و گویای این مطلب است که کونژوگاسیون با موفقیت انجام شده است. نتایج بررسی قدرت اپسینوفاگوسیتوزی آنتی بادی های القا شده نشان داد که 4 گروه موش BALAB/C ماده 6-5 هفته ای مورد بررسی قرار گرفتند بیشترین میزان میانگین مربوط به گروه کنترل بود. در تست آماری آنالیز واریانس یک طرفه با انحراف معیار (P<0/5) تفاوت معنی داری بین تمام گروه‌های مورد آزمایش مشاهده شد. با استفاده ازآزمون تعقیبی TUKEY مشخص شد بین تمامی گروه ها در مقایسه با گروه کنترل و نانو ذرات پلی لاکتید کو گلیکولیک اسید تفاوت معناداری وجود دارد. میانگین نتایج اپسینو فاگوسیتوزی در گروه کنترل به طور معناداری از همه گروه‌های دیگر بیشتر بود. درگروه‌های کنترل و نانو ذرات پلی لاکتید کو گلیکولیک اسید با توجه به این که از واکسن استفاده نشده بود تفاوت معناداری با توجه به نتایج درمقایسه با سایر گروه ها مشاهده شد که بیانگر این می‌باشد که درگروه‌های واکسینه شده با ترکیب های نانو ذرات و آنتی‌ژن LPS مقاومت و ایمنی‌زایی مناسبی نسبت به گروه‌های کنترل و نانو ذرات پلی لاکتید کو گلیکولیک اسید داشته است.پاسخ های ایمنی حاصل از اسپری ریوی موش‌ها ی تحت مطالعه در حذف باکتری ها از ریه بیماران مؤثر دیده شد. برای افزایش کارایی در تولید این واکسن ازنانوذره PLGA (پلی لاکتید کو گلیکولیک اسید) که دارای کمترین سمیت سیستماتیک در کاربردهای دارو رسانی می‌باشد استفاده شد. در این تحقیق پس از بررسی اپسینوفاگوسیتوز و چلنج در مدل موش BALB/C نتایج حاکی از این بود که موش‌هایی که نانو واکسن به همراه آنتی‌ژن دریافت کرده بوده اند فعالیت اپسینوفاگوسیتوزی بهتری نسبت به موش‌های گروه کنترل و نانو ذره و آنتی‌ژن خالص داشتند، همین طور در تست چلنج موش‌های دریافت کننده واکسن، باکتری‌های کمتری در طحال رشد کرده بود که نشان دهنده بهبود سیستم ایمنی بدن می‌باشد (جدول 1).نتایج حاصل از تست سنجش انفجارتنفسی نیتریک اکساید نیز نشان داد که برای گروه‌های واکسینه شده ازطریق اسپری ریوی، گروه‌های LPS و PLGA-LPS نسبت به گروه‌هایی که با نرمال سالین NS و نانو ذرات پلی لاکتیک کوگلیکولیک اسید اسپری ریوی شده بودند با بررسی آنالیز آماری یک طرفه با انحراف معیار 05/0 P <اختلاف معناداری داشتند (جدول 1). نتایج بررسی تیترآنتی بادی های IgG و IgM و SIgA در میکروپلیت کت شده با LPS به روش تست الیزا نوع غیر مستقیم نیز نشان داد که تیتر آنتی بادی IgG در شرایطی که موش‌ها را با ترکیب نانوذره پلی لاکتیک گلایکولیک و لیپوپلی‌ساکاریدکونژوگه شده به‌صورت اسپری ریوی واکسینه کرده بودند بیشترین تیتر آنتی بادی IgG به میزان cfu/well321 و دربررسی تست الایزا آنتی بادی IgM واکسن نانو ذرات پلی لاکتیک گلایکولیک اسید و آنتی‌ژن لیپوپلی‌ساکارید میزان تیتر آنتی بادی درموش‌های واکسینه با PLGA-LPS به مقدار 315 تیتر سرمی بوده و نتایج تست الایزا برای تیترآنتی بادی SIgA در گروه موش‌های واکسینه شده با PLGA-LPS به میزان cfu/well 365 بود و کمترین تیترمشاهده شده مربوط به گروه کنترل نرمال سالین و نانو ذرات PLGA بدست آمد. نتایج تست چلنج وشمارش کلنی‌ها بعد از واکسیناسیون و مواجهه‌ی موش‌ها با باکتری نشان داد که بین تمامی گروه‌ها در مقایسه با گروه کنترل و نانو ذرات پلی لاکتیک گلایکولیک اسید تفاوت معنی داری وجود دارد. میانگین تعداد کلنی‌های شمارش شده در گروه کنترل به طور معنی داری از همه گروه‌های دیگر بیشتر بود. در بررسی عضو ریه بیشترین کلنی مشاهده شده مربوط به گروه‌های کنترل و نانو ذرات پلی لاکتیک گلایکولیک اسید به تعداد cfu/lung580000 کلنی و سپس گروه‌هایی که فقط با آنتی‌ژن های لیپوپلی‌ساکارید بودکه ناحیه ی استنشاقی اسپری ریوی شده بودند و گروه‌های ترکیب نانو ذرات و آنتی‌ژن ها PLGA-LPS به نسبت کاهش یافته و به cfu/lung100 کلنی رسیده است. در بررسی عضو کبد بیشترین کلنی مشاهده شده مربوط به گروه‌های کنترل و نانو ذرات پلی لاکتیک گلایکولیک اسید به تعداد cfu/liver50000 کلنی و گروه‌های واکسینه با نانو ذرات و آنتی‌ژن ها لیپوپلی‌ساکارید کلبسیلاپنومونیه PLGA-LPS تعدادکلنی ها cfu/liver10 عدد دیده شد. در بررسی عضو طحال بیشترین کلنی مشاهده شده مربوط به گروه‌های کنترل و نانو ذرات پلی لاکتیک گلایکولیک اسید به تعداد cfu/spleen 42000 عدد بود و در گروه‌های واکسینه شده با نانو ذرات و آنتی‌ژن لیپوپلی‌ساکارید تعدادکلنی ها صفر 0 cfu/spleen شده بود و در عضو طحال کاملاعاری از کلنی بود.
بحث و نتیجهگیری
طبق نتایج حاصل از این تحقیق می توان گفت روی هم رفته، کپسوله سازی نانوذره PLGA با آنتی‌ژن های لیپوپلی‌ساکارید (با NHS به‌عنوان مولکول فاصله دهنده) به روش امولسیون W/O/W می‌تواند تحریک کننده ی پاسخ های ایمنی هومورال و سلولی را افزایش داده و بلع باکتری ها توسط ماکروفاژها در ریه، طحال، کبد صورت گیرد؛ بنابراین، از نانو واکسن PLGA-LPS به‌عنوان نامزد واکسن می توان درفاز اول کارآزمایی بالینی استفاده کرد. همچنین نامزد واکسن پیشنهادی پتانسیل بالایی برای حفاظت طولانی و پایدار نسبت به LPS خالص داشته و سبب فعال شدن لنفوسیت‌های T (T-helper) می‌گردد وبا تحریک سلول‌های T خاطره ای ایمنی ایجاد می‌کند. در ضمن نانوپارتیکل تهیه شده اپی توپ های پایداری را ایجاد کرده که با به دام انداختن آنتی‌ژن LPS دتوکسیفیه شده را به نحو بهتری به سیستم ایمنی بدن عرضه می نماید و نیز تیتر آنتی بادی های ترشح شده بر علیه PLGA-LPS را افزایش داد. واکسن طراحی‌شده با ترشح آنتی بادی ایمنی‌زایی را افزایش داده که همین موضوع واکسن تهیه شده را کاندید مناسبی علیه بیماری کلبسیلایی می نماید.
نمودار 1- مربوط به پتانسیل زتا آنتی‌ژن کپسول LPS
نمودار 2-مربوط به پتانسیل زتا آنتی‌ژن کپسول PLGA
نمودار3- مربوط به پتانسیل زتا آنتی‌ژن کپسول PLGA-LPS
نمودار4- مربوط به سایز نانو ذرات PLGA-LPS
نمودار 5- مربوط به سایز نانو ذرات PLGA
نمودار 6- مربوط به طیف‌سنجی FTIR واکسن طراحی‌شده با نانوذره پلی اتیلن گلیکولیک اسید
شکل 2- AFM مربوط به نانو ذرات PLGA-LPS
جدول1- میانگین نتایج به تفکیک گروه‌های واکسینه شده به روش اسپری ریوی در تست های اوپسینو فاگوسیتوز و. نیتریک اکساید.
|
میانگین Cfu/well |
تکرار
|
گروه |
|
|
نیتریک اکساید. |
اوپسینو فاگوسیتوز. |
||
|
09/0± 034/0 |
76/0 ± 1012 × 2/5 |
3 |
NS |
|
00/0± 058/0 |
09/1 ± 1011 × 18 |
3 |
PLGA |
|
06/0± 132/0 |
02/0 ± 100 |
3 |
D-LPS |
|
61/0± 523/0 |
13/0 ± 20 |
3 |
PLGA-DLPS |
نمودار 7- بررسی تست الایزا آنتی بادی های IgG و IgM و SIgA درمیکروپلیت کت شده با LPS
نمودار 8- بررسی چلنج اعضای ریه ، کبد و طحال در موش‌هایی که به روش اسپری از ناحیهی استنشاقی واکسینه شده بودند.
تحقیقاتی وجود دارد که از کپسول باکتری به‌عنوان آنتی‌ژن برای ساخت واکسن در بدن موجودات زنده استفاده شده است(15). Caroff و همکارانش در مصر، کل مولکول گلیکوپپتیدی دیواره‌ی باکتری کلبسیلاپنومونیه را که حاوی LPS و OMP بوده را جداسازی و استخراج نموده و توسط حذف اسیدهای چرب، کونژوگه ی LPS و OMP را دتوکسیفیه نمودند و کونژوگه ی حاصل در برابر عفونت‌های ادراری و سپتی سمی محافظت ایجاد نمود(4). نتایج استخراج PLGA در پژوهش حاضر نشان داد که اندازه آنتی‌ژن لیپوپلی‌ساکارید کلبسیلاپنومونیه مورد اندازه گیری قرارگرفته شده بودکه بیشترین جذب برای این آنتی‌ژن 270 nm = OD گزارش گردید. فرکشن های جمع آوری شده بعد از انجام ژل فیلتراسیون لوله های 98 و 99 در کونژوگه های PLGA -D-LPS وطول موج 270 نانومتر مربوط به آنتی‌ژن لیپوپلی‌ساکارید قرائت و لوله هایی که بیشترین جذب را در این طول موج داشتند به‌عنوان فرکشن های حاوی مولکول کونژوگه جمع آوری و با هم ادغام شدند. Chhibber و همکاران از پروتئین های سطح سلولی تنظیم کننده ی آهن یا iron regulated cell curface protein برای کونژوگاسیون با LPS کلبسیلا استفاده نمودند که نسبت به ترکیبات صنعتی، اثربخشی بسیار زیادی داشت و هم چنین روشی بی خطر بوده و تب زا نمی‌باشد. در نتایج و مقایسه ماکروفاژهای ریه حاوی آنتی‌ژن کانژوگه شده با سایر آنتی‌ژن ها مشخص شد که ایمنی‌زایی به‌واسطه‌ی افزایش فاگوسیتوز بود(5). این پژوهش در راستای پژوهش حاضر است. در مطالعه ی دیگری در سال 2005 توسط چیبر و همکارانش پلی ساکارید استخراج شده از LPS کلبسیلاپنومونیه NFC5055 به‌صورت کوآلان به توکسوئید تتانوس (کزاز) متصل کردند. محصول کونژوگه در دوز 100 میکروگرم غیر سمی بوده و اثر تب زایی نداشته و اثر ایمنی‌زایی آن به‌واسطه کاهش باکتری در ریه را نشان دادند. هم چنین خاصیت فعال‌سازی ماکروفاژها در ریه را داشته و موجب فعال شدن ماکروفاژها در این قسمت شدند(6). Zigtermanو همکاران واکسن کونژوگه ای تهیه کردند که از پلی ساکارید کلبسیلاپنومونیه(دو واحد تکراری تترا ساکارید) با سرم آلبومین گاوی(BSA) و KLH یا keyhole lymport hemocianin که هر دو آنتی‌ژن وابسته به تیموس تولید کردند. نتایج این تحقیق حاکی از افزایش چشم گیر مقدار آنتی بادی علیه این آنتی‌ژن ها بود و ایمنی‌زایی علیه موش‌های نر و ماده بررسی گردید و مشاهده شد که در هر دو گروه افزایش آنتی بادی صورت گرفته است. هم چنین در مقایسه با آنتی‌ژنی که به تنهایی تزریق گردیده، واکسن های کونژوگه موجب تولید تیتر آنتی بادی بیشتری شده اند(32). شاپوری و همکاران با بررسی ایمنی‌زایی کونژوگه PLGA با لیپوپلی‌ساکارید دتوکسیفای شده پروتئوس میرابیلیس علیه عفونت دستگاه ادراری در مدل موشی نشان داد که کونژوگه PLGA-LPS توانایی بهتری درپیشگیری از عفونت ادراری در موش سوری نسبت به LPS خالص دارد و می‌تواند سیستم ایمنی را بدون آثار مخرب در بافت های بدن تحریک کند(26). گادا و همکاران نشان دادند که PLGA در اتصال با پلی اتیلن گلیکول، N - سوکسینامید بهترین گزینه برای اعمال کونژوگاسیون این نانو ذرات با سایر ترکیبات است. در تحقیقی نیز، PLGA به‌عنوان حامل مناسب برای انتشار تسهیل یافته ی آنتی‌ژن ها با قابلیت لیگاند شدن اختصاصی با مولکول های هدف وافزایش معنادار پاسخ های ایمنی مورداستفاده قرارگرفته است(12). جهت استخراج آنتی بادی های IgG اختصاصی LPS بر علیه شیگلا دیسانتری تیپ I، SP-O این پاتوژن تخلیص شده و به توکسوئید کزاز اتصال می یابد بیشتر ایمنوژنیک های مورد استفاده یک اصلاح در روش منتشر شده هستند. نتیجه این که کونژوگه های TT-SP-O مقاوم بوده و در سطح بالایی از آنتی بادی های IgG ضد SP-O را ایجاد کرده و پاسخ های قوی تری را در مورد موش‌های جوان به هنگام تزریق زیر جلدی در سالمندان و در دوزی معادل 10/1 دوز مورد هدف که برای انسان مصرف می شود ایجاد می کند(29). چون و همکاران در سال 2019 اقدام به تهیه کونژوگه پلی ساکاریدO(OSP) شیگلا دیسانتری تیپ 1 با توکسوئیدکزاز به چندین روش نمودند و نشان‌دادند که روش آمیداسیون در مورد ساختارهای لیپوپلی‌ساکاریدی بهتر از بقیه ی روش ها سبب القای پاسخ های ایمنی حفاظت بخش می شود که احتمالاً به دلیل ایجاد ساختارهای مشبک در روش آمیداسیون و استفاده از فاصله گذار ADH است(10). در سال 2000 کانادو و همکارانش کونژوگه O - پلی ساکارید سالمونلا پارا تیفی را به توکسوئید کزاز متصل نمودند. در این روش دو نوع مولکول کونژوگه تهیه شد. در نوع اول از فاصله گذار ADH استفاده شد و در نوع دوم پروتئین مستقیماً به -O پلی ساکارید متصل گردید. ارزیابی ایمونولوژیکی با تزریق به موش مورد بررسی قرار گرفت و در هر دو ملکول کونژوگه آنتی بادی IgG ضد لیپو پلی ساکارید افزایش یافت. میزان تحریک تولید آنتی بادی توسط مولکول کونژوگه نوع اول در گروه سنی 1 تا 4 سال به مراتب بیشتر از ملکول نوع دوم بود(17).در سال 2012 فایلری و همکاران نانو ذرات زیست تخریب پذیر PLGA را به‌عنوان یک وسیله نقلیه برای تحویل پپتیدهای نوترکیب MOMP-187 کلامیدیا تراکوماتیس بررسی نمودند و نشان دادند که به طور موفقیت آمیز می توان MOMP را در PLGA کپسوله کرد و مهم تر از آن، PLGA موجب ارتقای ظرفیت پپتید برای وادار کردن Th1 برای تولید سایتوکاین ها می‌شود(11). در سال 2019 لیلا صفری زنجانی و همکاران در کار تحقیقاتی خود ازکونژوگه ی PLGA و اگزوتوکسین A سودوموناس آئروژینوزا به‌عنوان واکسن کارکردند(23). در تکنولوژی های جدید واکسن‌سازی از واکسن هایی استفاده می شود که در آن ذرات نانو به‌صورت حامل یا ادجوانت به کار رفته اند و کارایی بسیار بیشتری نسبت به واکسن های معمولی موجود در بازار را ارئه می دهند و به همین سبب تولیدات بیوتکنولوژی، مخصوصاً واکسن‌سازی به این سمت سوق یافته است. حال به طور مختصر نانو ذرات و نانو واکسن شرح داده خواهد شد. نانو ذرات به هر ذره ای که قطر کمتر از حدود 100 نانومتر داشته باشد گفته می‌شود(25). استفاده از نانو ذرات به‌عنوان راهی نو برای حامل های واکسن کلوئیدی جهت مصون سازی مورد بررسی قرار گرفته است(21). به طوری که نانو ذرات و میکرو ذرات تقریباً به اندازه باکتری ها و ویروس هایی هستند که سیستم ایمنی آن ها را تشخیص می دهد. هم چنین اندازه، ترکیب شیمیایی، شارژ و خصوصیات سطحی حامل های واکسن ویژه را می توان برای تحریک سلول های ارائه دهنده آنتی‌ژن(APs) و ارائه ایمن آنتی‌ژن ها تنظیم نمود(22). نانو ذرات زیست تخریب پذیر از دو ماده پلیمری ساخته شده‌اند که در ترکیبات پزشکی موجود به کار می‌روند؛ پلی لاکتیک-کو-گلیکولیک اسید که به نام PLGA شناخته می‌شود و پلی اتیلن گلیکول که به PEG معروف است. نانو ذرات پلیمری را برای تحویل انواع عوامل ضد میکروبی مورد بررسی قرار داده اند که کارایی درمان را در بسیاری از بیماری‌های عفونی بالا برده است(14).
)