بررسی تداخل اثر زهر عقرب Odontobuthus doriae و داروی سیکلوسپورین بر سطوح آنزیم‌های کبدی ALT، AST و بافت‌شناسی کبد در موش‌های کوچک آزمایشگاهی

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زیست شناسی، واحد دامغان، دانشگاه آزاد اسلامی، دامغان، ایران

2 آزمایشگاه مرجع رازی تحقیقات عقرب، موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، البرز، ایران

3 بخش جانوران سمی و تهیه پادزهر، مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، تهران البرز، ایران

4 بخش آسیب شناسی، موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، کرج، ایران

چکیده

زمینه و هدف: زهر عقرب در مواردی باعث تولید سیتوکین های پیش التهابی از جمله اینترلوکین-2 به عنوان واسطه سندرم پاسخ التهابی سیستمیک می شود. از سوی دیگر سیکلوسپورین خواص مهار سیتوکین به خصوص اینترلوکین-2 را دارد. مطالعه حاضر با هدف بررسی و شناخت مداخله دارویی جهت کنترل و درمان آسیب هیستوپاتولوژیکی بافت کبد ناشی از مکانیسم های آسیب زای التهاب عقرب گزیدگی با تزریق سیکلوسپورین و زهر عقرب Odontobuthus doriae انجام گرفته است.
روش کار: این مطالعه در موسسه سرم و واکسن سازی رازی کرج انجام صورت گرفت. در این تحقیق موش های سوری نر در 5 گروه ده تایی؛ گروه اول سرم فیزیولوژی، گروه دوم فقط یک دُز زیر حد کشندگی از زهر و گروه های 3 ، 4 و 5 علاوه بر یک دُز زیر حد کشندگی زهر، سیکلوسپورین را به ترتیب در دُزهای 10، 20 و 30 میلی گرم/کیلوگرم/ روز دریافت کردند. تعیین سطوح اینترلوکین-2، آلانین آمینوترانسفراز، آسپارتات آمینوترانسفراز سرمی و نیز تغییرات بافتی کبد با نمونه برداری از بافت کبد انجام شد.
یافته ها: تزریق زهر باعث افزایش مقادیر اینترلوکین-2(05/0 P)، آلانین آمینوترانسفراز، آسپارتات آمینوترانسفراز سرم و درمان با سیکلوسپورین کاهش معنی دار سطح اینترلوکین-2 (05/0 P) و آلانین آمینوترانسفراز، آسپارتات آمینوترانسفراز را نشان داد. مطالعات بافت شناسی بهبود آسیب های اِدم، خون ریزی و پرخونی بافت کبد را در گروه ها پس از تزریق سیکلوسپورین در مقایسه با گروه دریافت کننده زهر نشان داد.
نتیجه گیری: درمان با سیکلوسپورین موجب کاهش قابل توجه اثرات زهر عقرب بر روی مقدار اینترلوکین-2 و هم چنین مقادیر آلانین آمینوترانسفراز، آسپارتات آمینوترانسفراز و آسیب بافت کبدی می گردد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Interaction of Odontobuthus doriae Scorpion Venom and Cyclosporine on Levels of Liver Enzymes ALT, AST and Liver Histology in Mice

نویسندگان [English]

  • Malihe Moshiri 1
  • Abdolhossein Shiravi 1
  • Shahrokh Navidpour 2
  • Hossein Zolfagharian 3
  • Mohammad Eslampanah 4
1 Department of Biology, Damghan Branch, Islamic Azad University, Damghan, Iran
2 Razi Reference Laboratory of Scorpion Research (RRLS), Razi Vaccine & Serum Research Institute, Agricultural Research Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, IRAN
3 Razi Reference Laboratory of Scorpion Research (RRLS), Razi Vaccine & Serum Research Institute, Agricultural Research Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, IRAN
4 Department of Pathology, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization, Karaj, Iran
چکیده [English]

Inroduction & Objective: Scorpion venom sometimes causes the production of pro inflammatory cytokines, including interleukin-2, as a mediator of the systemic inflammatory response syndrome. On the other hand, cyclosporine has cytokine inhibitory properties, especially interleukin-2. The aim of this study was to evaluate and identify the drug intervention to control and treat histopathological liver tissue failure caused by the harmful mechanisms of scorpion sting inflammation by injection of cyclosporine and Odontobuthus doriae scorpion venom.
Material and Method: This study was performed in Razi Serum and Vaccine Institute of Karaj and in this study male mice in 5 groups of 10; The first group of normal saline, The second group has only one sub-lethal dose of venom and groups 3, 4 and 5 in addition to one sub-lethal dose of venom, Cyclosporine was given at doses of 10, 20 and 30 mg/kg/day, respectively. Serum levels of interleukin-2, Alanine aminotransferase, Aspartate aminotransferase and liver tissue changes were determined by sampling liver tissue.
Results: Venom injection significantly increased the serum levels of interleukin-2 (P <0.05), Alanine aminotransferase, Aspartate aminotransferase and treatment with cyclosporine showed a significant decrease in the serum levels of interleukin-2 (P <0.05) and Alanine aminotransferase, Aspartate aminotransferase. Histological studies showed improvement in edema, hemorrhage, and hepatic hyperemia in the groups after cyclosporine injection compared with the venom group
Conclusion: Cyclosporine treatment significantly reduces the effects of scorpion venom on interleukin-2 levels, as well as the levels of alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, and liver tissue injury.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Scorpion
  • Venom
  • Cyclosporine
  • Liver Failure
  • Immunosuppressor

مقدمه

 

یکی از گونه های مهم خانواده بوتیده در ایران عقرب ادنتوبوتوس دوریه (Odontobuthus doriae) است. عقرب گزیدگی توسط این خانواده از عقرب ها باعث ایجاد چندین علائم بالینی پیچیده در دستگاه های مختلف و به طور عمده در سیستم عصبی، قلبی عروقی، تنفسی، افزایش تحرک دستگاه گوارش، فشار خون شریانی و به دنبال آن افت فشار خون، نارسایی کبدی، شوک و هم چنین سندرم پاسخ التهابی سیستمیک (SIRS: Systemic inflammatory response syndrome)  می شود، که می­تواند منجر به مرگ گردد(24). عموماً این اختلال ها توسط اثرات انتقال دهنده های عصبی منتشر شده توسط زهر عقرب توضیح داده می شوند، اما در این بین آزاد شدن واسطه های پاسخ التهابی سیستمیک که می تواند نقش مهمی داشته باشد را نباید از نظر دور داشت(20). آسیب بافت به عنوان یکی از عوامل آزادکننده واسطه های التهابی می تواند باعث بروز سندروم پاسخ التهابی سیستمیک شود(17). به دنبال بروز آسیب بافت، سیتوکین­های پیش التهابی مانند اینترلوکین-1 و 2 و عامل نکروز دهنده تومور، اینترلوکین-6 و 12 و اینترفرون گاما افزایش می یابند(14). پاسخ التهابی با فعال شدن سلول­های سیستم ایمنی بدن پس از تحریک توسط سیتوکین های پیش التهابی مانند اینترلوکین IL-1ß ، فاکتور نکروز دهنده تومور (TNF-α)، اینترفرون گاما (INF-γ)، IL-6، IL-8 و IL-2 مشخص می شود(14). با این حال، تولید بیش از حد این سیتوکین های پیش التهابی که به طور کلی در اولین ساعات عقرب گزیدگی اتفاق می افتد(16)، می­تواند باعث اختلال در عملکردهای متعدد ارگان ها شده و حتی سبب مرگ به ویژه در کودکان می گردد(20) .نظر به این که سیتوکین های پیش التهابی مانند IL-l ß ، IL-6 و TNF-α مسئول شروع فعالیت دفاع مؤثر در برابر پاتوژن­های خارجی هستند، تولید بیش از حد این واسطه ها می­تواند مضر باشد و در نهایت ممکن است منجر به شوک، نارسایی اندام های متعدد و مرگ شود(14). به تازگی فعال شدن سیستم ایمنی در بیماران عقرب گزیده با افزایش سطح سرمی اینترلوکین-6 گزارش شده است که این سیتوکین توسط مونوسیت ها، ماکروفاژها، سلول های اندوتلیال، فیبروبلاست ها و سایر سلول ها در پاسخ به تحریکات التهابی ترشح می شوند(14،20).اینترلوکین-2 (interleukin-2)  به طور عمده توسط سلول های نوع Th1 ترشح و در شروع پاسخ‌های التهابی و ایمنی نقش دارد به این صورت که اینترلوکین-2 نوعی سیتوکین سیستم ایمنی است که تنظیم کنندۀ فعالیت سلول های سفید خون از جمله لنفوسیت ها و لوکوسیت ها می باشد. این سیتوکین اثرات خود را بر سلول های مختلفی از جمله لنفوسیت های T اعمال می نماید و با اثرات ضدآپوپتوزی در سیستم ایمنی و نیز تأثیر بر متابولیسم سلولی، نقش مهمی را در سلول های T ایفا می نماید. اثر اینترلوکین-2 در تکثیر سلول های T به صورت مؤثر نشان داده شده است. ازسوی دیگر، عملکردهای IL-2 نیز در سلول های B بی­تاثیر نیست و این سیتوکین در ترشح آنتی بادی ها از سلول­های B نیز نقش دارد. علاوه بر اثرات این فاکتور بر سلول های T وB، این سیتوکین به عنوان فاکتور رشد سلول های کشندۀ طبیعی و افزایش تولید سیتوکین های آزادشده از سلول های کشندۀ طبیعی مانند فاکتور نکروزدهندۀ تومور آلفا و اینترفرون گاما و نیز در مقابله با سیتوکین های پیش التهابی که البته باید بیش از حد نیاز باشند تا روند افزایش علائم بالینی را کاهش دهند را به تعادل می رساند(1،14).در حـال حاضـر راه اصلی درمان عقرب گزیدگـی در ایران اسـتفاده از سـرم ضـد زهـر عقرب اسـت که بیشتر محققین، آنتی سرم را به عنوان تنها درمان اختصاصی عقرب گزیدگی مفید می دانند. گزارش شده است که استفاده از پادزهر چند ظرفیتی در مدت زمان کوتاهی پس از تزریق می تواند باعث کاهش پاسخ التهابی مربوط به تغییرات سیستمیک طی افزایش سیتوکین ها (IL-6، IL-1α و TNF-α) در عقرب گزیدگی شود(27،30). از آن جایی که تهیه پادزهر عقرب معمولاً از اسب که دارای تفاوت های ژنتیکی با انسان را دارد، ممکن است در برخی از بیماران منجر به واکنش آنافیلاکسی شود(20،21) و مقادیر بیشتر آن هم، خطر بروز بیماری سِرم (Serum sickness) را به همراه دارد و با توجه به احتمال گزیدگی مجدد افراد و دریافت آنتی سرم های اسبی و تجمع آن در بدن امکان ایجاد شوک آنافیلاکتیک افزایش می یابد که در مواردی سبب مرگ بیمار می گردد. بنابراین قبل از تزریق سرم ضد زهر انجام تست پوستی ضروری می نماید و در صورت مثبت بودن تست امکان استفاده از آنتی سرم مقدور نیست. لذا در این شرایط تجویز دارویی می تواند یکی از راه های موثر در درمان این بیماران باشد(10). گروهی از محققین روش درمانی فوق را در پیشگیری از بروز عوارض ناشی از عقرب گزیدگی روی برخی اندام ها بی اثر می دانند بنابر این استفاده از آنتی سرم در درمان عقرب گزیدگی ها مورد بحث می باشد(25،26). هم چنین گروهی دیگر از محققین معتقدند درمان دارویی یکی از راه های موثر در کاهش اثرات ناشی از عقرب گزیدگی می باشد(2). لذا بررسی در مورد استفاده از برخی داروها برای مهار التهاب به خصوص اینترلوکین-2 در درمان بیماران گزیده شده در مناطقی که در معرض خطر هستند، می تواند موثر باشد. داروی سیکلوسپورین جدا شده  از قارچ خاکی Tolypocladium inflatum gams باعث مهار اینترلوکین -2 و در نهایت سرکوب سیستم ایمنی را می شود(7). سیکلوسپورین (cyclosporine)پپتیدی حلقوی، هیدروفوب و خنثی، شامل 11 اسیدآمینه می باشد که از سال 1987 به عنوان یک مهار کننده سیستم ایمنی در پیوند اعضاء و بیماری های خود ایمنی مثل پســوریازیس، آرتریت روماتوئید، دیابت نوعI ، سندرم بهجت و غیره مصرف می شــود. مکانیســم اثر دارو مهار انتخابی فعالیت سلول های T و مهار تولید اینترلوکین-2 است. لذا ساختار مولکول سیکلوسپورین از یک حلقه اندکاپپتید (endecapeptide) آبگریز ساخته شده است که پس از ورود به یاخته، به پپتید درون یاخته‌ای سیکلوفیلین (cyclophilin) متصل می‌شود. سیکلوفیلین، متعلق به گروهی از پـروتئین‌هـای تنـظیـم کننـده ایمـنی به‌نـام ایمـونـوفیلیـن (immunophilin) می باشد، به‌نظر می‌رسد که کنترل تولید پروتئین‌هایی را بر عهده داشته باشد که در فعال شدن یاخته‌های T دخالت دارند. بنابر این با جلـوگیری از ساخته شدن این پروتئین، تولید اینترلوکین‐۲ متوقف می‌گردد و چون ۲IL‐  برای فعال شدن یاخته‌های T لازم است؛ فعالیت یاخته‌های CD4+ و CD8+ نیز متوقف می‌شود. در واقع، هم ایمنی یاخته‌ای و هم ایمنی هومورال سرکوب می‌شود. سیکلوسپورین هم چنین تولید بقیه لنفوکین‌ها مانند اینترفرون گاما و بروز گیرنده‌های اختصاصی ۲IL‐  بر سطح یاخته را مهار می‌کند(7، 6). هدف از این مطالعه اندازه گیری مقادیر اینترلوکین-2 و سطوح سرمی آنزیم‌های آلانین آمینوترانسفراز(ALT)، آسپارتات آمینوترانسفراز (AST) به علاوه تغییرات هیستوپاتولوژیک کبد از جمله اِدم، پرخونی و خونریزی در عقرب گزیدگی ادنتوبوتوس دوریه به دنبال تجویز داروی سیکلوسپورین می باشد.

مواد و روش ها

زهر

زهر خالص لیوفیلیز شده عقرب ادنتوبوتوس دوریه در بخش جانوران سمّی موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی کرج تهیه شد. ابتدا از زهر خشک یک محلول حاوی 10 میلی گرم زهر در 10 میلی لیتر سرم فیزیولوژی ساخته، سپس در 5000 دقیقه در دور (rpm) به مدت 30 - 10 دقیقه سانتریفوژ گردید تا موکوس و مواد اضافه موجود در زهر ته نشین شود. پس از آن مایع رویی جمع آوری و محلول حاصل حاوی زهر خالص است(12).

سنجش دُز زیر حد کشندگی زهر

برای تعیین دُز زیر حد کشندگی (Sublethal doses) زهر، ابتدا متوسط دُز کشندگی (LD50) زهر خام O. doriae   با غلظت های مختلف به موش های سوری نژاد Balb/c  با وزن2/0 ± 20 گرم تزریق و با استفاده از روش Spearman & Karber  میزان LD50 محاسبه شد(23). پس از تعیین غلظت زیر حد کشندگی، به روش گفته شده غلظت زهر در زیر حد دوز خطرناک به صورت داخل صفاقی به حیوانات تزریق گردید.

حیوانات و گروه بندی

موش‌های سوری نر نژاد Balb/c، شش هفته ای در محدوده وزن 2 ± 23 گرم از حیوان خانه موسسه واکسن و سرم سازی رازی تهیه و در اطاق حیوانات در شرایط استاندارد در چرخه نور 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی و دمای محیط 2 ± 22 درجه سانتی گراد یک هفته قبل از آزمایش نگهداری شدند. تمام مراحل بر اساس پروتکل استاندارد انجام گرفت(9). در این مطالعه، پنج گروه 10 تایی موش مورد آزمایش قرار گرفتند

گروه اول: در این گروه حیوانات، سرم فیزیولوژی 1/0میلی مولار را به مدت یک هفته به صورت داخل صفاقی دریافت کردند.

گروه دوم: این گروه زهر عقرب O. doriae زیر حد کشندگی را برای یک بار با تزریق داخل صفاقی دریافت کردند.

گروه 3، 4 و 5: گروه های دریافت کننده سیکلوسپورین ویال 50 میلی لیتر/ میلی گرم، ساخت شرکتNovartis  سوئیس دریافت کردند. موش های دریافت کننده زهر عقرب زیر حد کشندگی یک ساعت پس از تزریق سیکلوسپورین را به ترتیب با دُزهای 10، 20 و 30 mg/kg/day   با سرنگ انسولین به صورت داخل صفاقی به مدت یک هفته تزریق گردید(11،18،22).

نمونه گیری و خون گیری

در پایان دوره درمان، حیوانات تحت تأثیر اتر بیهوش و خون گیری از قلب آن ها صورت گرفت. نمونه های خونی گرفته شده از گروه های مختلف به منظور جداســازی سـرم از خون، با سـرعت 3000 دور در دقیقــه بـــه مـــدت 15 دقیقـــه سانتریفیوژ و تا قبل از مطالعه اندازه گیری سطوح IL-2، ALT و AST در شرایط فریزر(دمای 20 - درجه سانتی گراد) تا انجام آزمایش نگهداری شدند.

مطالعات آنزیمی

سنجش فعالیت آنزیم های کبدی آسپارتات آمینو ترانسفراز (AST) و آلانین آمینو ترانسفراز (ALT) از کیت های آنزیمی (شرکت پارس آزمون-کرج/ایران) توسط روش پیشنهادی فدراسیون بین المللی شیمی بالینی و طب آزمایشگاهی (IFCC: International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine)  و دستگاه اسپکتروفوتومتری اندازه گیری شدند(29). مقادیر به دست آمده بر اساس واحدهای بین المللی در لیتر (U/L ثبت شد.

الایزا

اندازه گیری سطح سرمی اینترلوکین-2 به روش الایزا بر اساس برنامه کیت شرکت Mabtech AB (Nacka Strand, Sweden)  صورت پذیرفت و پس از تکمیل فرآیندها طبق دستورالعمل های مربوطه به شرح زیر انجام شد:

  1. 1. تمام معرف ها، نمونه ها و استانداردها را طبق دستور تهیه گردید.
  2. 100میکرولیتر استاندارد یا نمونه به هر چاه اضافه کنید. یک شب در دمای 4 درجه سانتی گراد انکوبه شد.
  3. 100میکرولیتر آنتی بادی آماده شده بیوتین(biotin) را به هر چاهک اضافه و 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه گردید.

4- 100میکرولیتر محلول آماده سازی استرپتویدین(streptavidin solution)  را اضافه 45 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد.

5- 100میکرولیتر TMB یک مرحله ای (TMB one-step) معرف بستر را به هر چاه اضافه و 30 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد.

6-اضافه کردن 50 میکرولیتر محلول متوقف کننده به هر چاه انجام گردید.

7-بلافاصله توسط دستگاه الایزا ریدر روی طول موج nm 450  خوانش انجام شد.

با مقایسه اعداد حاصل با استانداردها، سطح سرمی نمونه ها به دست آمد. مقادیر به دست آمده بر اساس واحدهای پیکوگرم بر میلی لیتر (pg/ml) ثبت گردید.

مطالعه بافت شناسی کبد

پس از کالبدگشایی، بافت کبد تمام موش ها نمونه­برداری و نمونه های ثابت شده در فرمالین به روش معمول در پارافین جاسازی شدند. تهیه مقاطع بافتی 5 میکرومتری (µm) از بلوک های پارافینه انجام و با هماتوکسیلین و ائوزین (H&E)رنگ آمیزی شده و در نهایت با میکروسکوپ نوری مورد بررسی قرار گرفت.

تحلیل آماری

داده ها با میانگین و انحراف از معیار (SD) مورد ارزیابی قرار گرفتند. برای تحلیل و مقایسه نتـایج بین هر دو گروه از آزمون T Test و برای تحلیل و مقایسه نتـایج بیشتر از دو گروه از آزمـون تحلیل واریانس یک طرفه (ANOVA) روش آزمون Tukey برای مقایسه وجود اختلاف معنی دار بین مشخصــــه هــــای مختلــــــف در نرم افزارهای SPSS استفاده شد. ســـــــطح معنـی داری کمتر از 05/0 در نظر گرفته شد.

نتایج

غلظت زیر حد کشندگی

متوسط دُز کشندگی (LD50) محاسبه شده با استفاده از روش اسپیرمان- کاربر (19،21) معادل 14/0 میلی گرم به ازای کیلوگرم وزن بدن و غلظت زیر حد کشندگی عقرب ادنتوبوتوس دوریه 07/0 mg/kg از وزن بدن در موش سوری بود (جدول 1).

 نتایج اندازه گیری IL-2

میزان اینترلوکین-2 در گروه های آزمایشی موش های سوری در جدول 2 درج شده است. همان گونه که آشکار است تزریق زهر به میزان زیر حد کشندگی در گروه 2 با افزایش معنی دار سطح IL-2 سرم در مقایسه با گروه 1 همراه بوده است(05/0≥p). بر اساس نتایج به دست آمده از پژوهش حاضر سطح IL-2 در گروه های 3، 4 و 5 در مقایسه با مقدار IL-2 در گروه 2 به صورت معنی دار کاهش یافت است(05/0≥p). به نظر می رسد درمان با سیکلوسپورین توانسته است در بهبود وضعیت عقرب گزیدگی در گروه های مداخله مؤثر باشد.

 

 

جدول 1- نتایج حاصل از آزمایشات تعیین دُز کشنده زهر عقرب ادنتوبوتوس دوریه

گروه

دُز (mg/kg)

تفاوت دُز (mg/kg)

تعداد حیوانات در هر گروه

تعداد

مرگ موش

میانگین مرگ موش

تفاوت دُز ×

میانگین مرگ موش

1

کنترل

-

5

0

0

0

2

0.05

0.05

5

1

0.5

0.025

3

0.1

0.05

5

2

1.5

0.075

4

0.2

0.1

5

4

3.0

0.3

5

0.4

0.2

5

5

4.5

0.9

جمع کل

         

1.3

LD50 (O. doriae) = 0.40 - = 0.14 mg/kg

 

جدول 2- اثر زهر عقرب Odonthobuthus doriae و داروی سیکلوسپورین بر میانگین((Mean ± SD میزان سطوح سرمی IL-2، ALT و AST موش‌های سوری

 n=10

گروه 1

گروه 2

گروه 3

گروه 4

گروه 5

P value

IL-2(pg/mL)

0.11 ± 0.010

0.121 ± 0.011*

0.120 ± 0.012*

0.111 ± 0.011

0.109 ± 0.011**

S

ALT (U/L)

61 ± 15.96

89.75 ± 39.33

79.83 ± 29.76

79.6 ± 29.30

79.4 ± 37.18

NS

AST (U/L)

97.3 ± 21.59

135.42 ± 52.94

131.1 ± 35.32

128 ± 36.07

109.16 ± 25.47 

NS

ANOVA: NS: عدم معنی داری, S: معنی داری

*آزمون  T-Test معنی داری گروه ها: آزمون T-Test  مقایسه بین گروه 1 و گروه 2

**آزمون  T-Test معنی داری گروه ها: آزمون T-Test  مقایسه بین گروه 2 و گروه 5

 

تغییرات متابولیک

مقدار آلانین آمینو ترانسفراز(ALT) در گروه های آزمایشی موش های سوری در جدول 2 درج شده است. میانگین ALT در سرم گروه 2 برابر با (33/39 ± 75/89) بود میانگین گروه 1 برابر با (96/15 ± 61) مشاهده شد با توجه به نتیجه آزمون اختلاف آماری معنی داری مشاهده نشد (09/0=p). میانگین ALT سرم در گروه 3 (76/29 ± 83/79) نسبت به گروه 4 (30/29 ± 6/79) و گروه 5 (18/37 ± 4/79) اختلاف ناچیز داشتند. با توجه به این که میانگین های ALT گروه 3، 4 و 5  در مقایسه با میانگین ALT گروه 2 پایین تر بود ولی تفاوت آماری معنی داری نشان نداد(53/0= P).میزان آسپارتات آمینو ترانسفراز(AST) در گروه های آزمایشی موش های سوری در جدول 2 ارائه شده است. میانگین AST در سرم گروه 2 برابر با (94/52 ± 42/135) و میانگین گروه 1 برابر با (59/21 ± 33/97) بود و با توجه به آزمون آماری اختلاف معنی دار نبود. پس از تزریق سیکلوسپورین، در گروه  3 (32/35 ± 16/131)، گروه 4 (07/36 ± 128) و گروه 5 (47/25 ± 16/109) سطح AST در هر سه گروه نسبت به گروه 2 کاهش یافته و لیکن تفاوت مقادیر AST در این گروه ها معنی دار نبود. هر چند در این گروه ها به ترتیب مقدار AST روند کاهشی را نشان می داد (32/0= P).

نتایج مطالعه بافت شناسی کبد

مطالعه بافت شناسی کبد روی گروه های آزمایشی موش های سوری در جدول 3 و شکل 1 نشان داده شده است. نتایج مطالعه هیستوپاتولوژی بر روی موش های سوری نژاد Balb/c گروه 2 نشان داد که زهر زیر حد کشندگی عقرب ادنتوبوتوس دوریه بر روی کبد اثر گذاشته و باعث پر خونی و خون ریزی متوسط در پارانشیم بافت کبد و هم چنین نواحی ادماتوز بافت کبد مشاهده شد( شکل 1 و جدول 3). آسیب شناسی بافتی کبد در موش های گروه 1 هیچ گونه تغییر پاتولوژیک قابل ملاحظه ای را نشان نداد. در گروه های تیمار شده با دُزهای مختلف سیکلوسپورین به ترتیب 10، 20 و 30 mg/kg/day در مقایسه با گروه 2 همه ی علایم مذکور بهبودی نشان دادند. در هر حال در گروه 3 اِدم ملایم در بافت و کانون های پرخونی و خون ریزی در پارانشیم بافت کبد در مقیاس خفیف مشاهده شد( شکل 1 و جدول 3). در مجموع، گروه 4 از نظر بافت شناسی وضعیت بهتری نسبت به گروه 3 داشت و به طور تقریبی به سطح طبیعی برگشته بود و هیچ تغییر قابل ذکری در آن دیده نشد(شکل 1 و جدول 3). گروه 5 اختلاف معنی داری را با گروه 1 نشان نداد اما تا حدودی کانون­های پرخونی و خون ریزی و اِدم ملایم در پارانشیم بافت کبد مشاهده شد(شکل 1 و جدول 3).

بحث و نتیجه گیری

عقرب گزیدگی شدید یک سندرم پاسخ التهابی سیستمیک ایجاد می کند که ممکن است باعث شوک، آسیب بافت کبد و کلیه، اختلال عملکرد قلبی و ریوی شود(15). این مطالعه بدین منظور طراحی گردید تا میزان سطح سرمی اینترلوکین-2 ، آلانین آمینوترانسفراز، آسپارتات آمینوترانسفراز و نیز تغییرات هیستوپاتولوژیک(اِدم، خون ریزی و پرخونی) را در بافت کبد موش های سوری نر تیمار شده با سیکلوسپورین پس از دریافت زهر زیرحدِّ کُشندگی عقرب ادنتوبوتوس دوریه مورد بررسی قرار دهد. پس از دریافت زهر عقرب در موش سوری میزان اینترلوکین-2، آلانین آمینوترانسفراز و آسپارتات آمینوترانسفراز سرم افزایش یافت که موجب تغییرات آسیب شناسی در بافت کبد به صورت پر خونی و خون ریزی متوسط در پارانشیم بافت کبد به علاوه نواحی ادماتوز گردید. تیمار با سیکلوسپورین موجب کاهش معنی دار سطح سرمی اینترلوکین-2 گردیده و به نسبت افزایش دُز سیکلوسپورین، کاهش بیشتری در سطح سرمی اینترلوکین-2 مشاهده شد و به حد نرمال رسید. با استناد به این که فعال سازی و انتشار سیتوکین های پیش التهابی ممکن است در پاتوفیزیولوژی مسمومیت ناشی از عقرب گزیدگی نقش مهمی داشته و تظاهرات سندرم پاسخ التهابی سیستمیک و نارسایی اندام­ها مانند اختلال عملکرد قلبی، ریوی و آسیب بافت کبد و کلیه را نیز به خود اختصاص دهد(14). به نظر می آید سیکلوسپورین توانسته بر التهابات ناشی از سیتوکین پیش التهابی اینترلوکین-2 در موش های دریافت کننده زهر عقرب فائق آید. مطالعات مختلف نشان می دهد زهر عقرب موجب افزایش قابل توجهی از سیتوکین های پیش التهابی می شود و از آن جایی که بیشتر مطالعات در مورد سیتوکین های پیش التهابی مانند IL-1α، IL-1β، IL-6، TNF-α و IFN-γ انجام شده است(14،16،20). در این مطالعه تأثیر زهر عقرب ادنتوبوتوس دوریه بر میزان اینترلوکین-2 و ارزیابی اثربخشی احتمالی سیکلوسپورین در عقرب گزیدگی بررسی شد. برای اثبات این نقش و مکانیسم عمل آن به مطالعات بیشتری نیاز است. هم چنین در تحقیق حاضر سیکلوسپورین باعث کاهش میزان آلانین آمینوترانسفراز، آسپارتات آمینوترانسفراز سرمی شده اما تفاوت معنی داری با گروه دریافت کننده زهر عقرب مشاهده نشد. از سوی دیگر سیکلوسپورین در دُز 30 mg/kg/day بیشترین اثرات را بر روی کاهش آنزیم­های کبدی پس از دریافت زهر عقرب داشته است. از این رو سیکلوسپورین می تواند با اثر بر عملکرد زهر، التهاب را کاهش دهد. از آن جایی که AST به عنوان آنزیم ترانسفراز در تمام قسمت های بدن توزیع می شود، اما بیشتر در قلب و کبد متمرکز است. ALT ، با فعالیت مشابه AST، به عنوان آنزیم مخصوص کبد در نظر گرفته می شود و در افزایش نارسایی کبدی یا التهاب، بیشتر از AST افزایش می یابد(1). لذا با توجه به نتایج مطالعات انجام شده قبلی در مورد حیوانات دریافت کننده زهر عقرب مانند خرگوش، رت و موش می توان نتیجه گرفت که افزایش AST و ALT سرم به دلیل ایجاد نارسایی کبدی در موش های تحت آزمایش می باشد(5،28). علل افزایش سطح AST را می توان انفارکتوس میوکارد یا نارسایی کبدی دانست(1). بنابراین، افزایش سطح AST و ALT در این مطالعه ممکن است ناشی از اقدام مستقیم زهر بر روی کبد باشد. به طور مشابهی، افزایش معنی دار فعالیت آنزیم های آلانین آمینوترانسفراز، آسپارتات آمینوترانسفراز نسبت به گروه شاهد در تزریق زیر جلدی زهر عقرب Androctonus crassicauda به موش های صحرایی، توسط اوزکان و همکاران گزارش شد(13). زارع و همکاران نیز نشان دادند که تزریق وریدی زهر عقرب ادنتوبوتوس دوریه باعث افزایش معنی داری در میزان سطوح AST و ALT در سرم خرگوش نژاد New Zealand White می باشد. آن ها پیشنهاد کردند که آشفتگی درونی(autonomic storm) و انتشار کاتکول آمین ها می تواند دلیل افزایش میزان AST و ALT سرمی باشد(29).

 

 

جدول3- مقایسه شدّت تغییرات هیستوپاتولوژیک بافت کبد در موش های دریافت کننده زهر عقرب O. doriae تحت درمان با دوز های مختلف سیکلوسپورین

 

 
    
            آسیب ها

گروه 1

گروه 2

گروه 3

گروه 4

گروه 5

 

اِدم

+/-

++

+

+

+

 

پرخونی

+/-

++

+

+

+

 

خونریزی

+/-

++

+

+

+

 

-: عدم مشاهده تغییرات بافتی (تقریباً در حد صفر)     +: آسیب خفیف(Mild))     ++: آسیب متوسط (Moderate)

 
 

 

 

 

 

 

شکل 1- بررسی تغییرات بافت­شناسی کبد در موش های دریافت کننده زهر عقرب O. doriae تحت درمان با دوز های مختلف سیکلوسپورین.

الف) گروه 1. بافت نرمال رنگ آمیزی H&E × 40، × 10  ب) گروه 2 (دریافت کننده زهر عقرب O. doriae). رنگ آمیزی H&E × 4 ج) گروه های دریافت کننده سیکلوسپورین. رنگ آمیزی H&E × 10، × 4 A: اِدم  B: پرخونی  C: خونریزی

 

در مطالعه Chaubey نیز گزارش شده که تزریق زهر عقرب Mesobuthus tamulus gangeticus از خانواده بوتیده در موش آلبینو باعث افزایش ALT در سرم خون که نشان دهنده آسیب کبد بعد از تجویز زهر M. tamulus gangeticus می باشد. هم چنین به اذعان این نویسنده علل اصلی تغییرپذیری سلول های بافت کبد عبارتند از: هیپوکسی گردش خون، اختلالات متابولیک و التهاب است(3). در نتایج تحقیق زایرزاده و همکارانش نیز ثابت شد که تزریق زهر عقرب Mesobuthus eupeus باعث افزایش در سطوح سرمی ALT و AST در خرگوش نر نژاد New Zealand white می شود بنا به اظهار محققین زهر عقرب می تواند اقدامات انتخابی بر روی کانال های سدیمی دریچه دار وابسته به ولتاژ داشته باشد و این باعث انتشار گسترده انتقال دهنده های عصبی خودمختار می شود. بنابراین، آسیب های کبدی می تواند به دلیل رهاسازی گسترده کاتکول آمین ها و در نتیجه انقباض عروق و فشار خون بالا در کبد باشد. به علاوه آن ها به این موضوع اشاره کردند که این آسیب ها ممکن است در اثر سایر مواد مرتبط با عقرب گزیدگی مانند سیتوکین های پیش التهابی و واسطه های التهابی ایجاد شود(5،8). در این راستا با توجه به نتایج تحقیق حاضر که افزایش معنی دار اینترلوکین-2 بعد از دریافت زهر عقرب را نشان داد، احتمال آسیب بافت کبد بسیار بالاست.علاوه بر این بررسی اثرات درمان با سیکلوسپورین بر آسیب شناسی بافت کبد بعد از دریافت زهر عقرب در پژوهش حاضر، بیانگر تاثیر مثبت و بهبود ادم، پرخونی،خون ریزی در بافت کبد بود. همان طور که نتایج بررسی پاتولوژی بافت کبد با تزریق زهر زیر غلظت کشندگی عقرب ادنتوبوتوس دوریه نشان دهنده ی آسیب های متوسط (Moderate) ادم، پرخونی و خون ریزی در بافت کبد شد. در گروه­هایی که با سیکلوسپورین دُز 10 و 20 mg/kg/day تیمار شدند، آسیب ها در حد خفیف مشاهده شد و با دُز 30 mg/kg/day تا حدودی کانون های پرخونی و خون ریزی و اِدم ملایم مشاهده گردید. رهروانی و همکاران در مطالعه خود بر روی آثار تزریق زیر جلدی زهر عقرب همی سکورپیوس لپتوروس به گوسفند های بومی نر نشان دادند که بیشترین آسیب های بافت شناسی خون ریزی و پرخونی در بافت کبد و کلیه روی داده است. که به اعتقاد این محققین به واسطه ی آسیب عروقی می باشد به علاوه آسیب عروقی دلیلی بر ایجاد ادم در بافت کبد است(17). به علاوه در مطالعات بافت شناسی زایرزاده و همکارانش3 تا 5/3 ساعت پس از تزریق زهر عقرب Mesobuthus eupeus به خرگوش خون ریزی کانونی، پرخونی ورید مرکزی، پرخونی عروق در مناطق پورتال در کبد گزارش دادند(31). در مطالعه ی دهقانی و همکاران فراوانی تغییرهای پاتولوژیک در کبد موش های صحرایی دریافت کننده زهر عقرب هموسکورپیوس 76 درصد بوده که این تغییرها، پرخونی و خونریزی خفیف تا شدید را شامل گشته است. و بنا به اظهار این محققین، احتقان و تغییرات هیدروپیک سلول های کبدی به علت تحریک اعصاب سمپاتیک، سبب افزایش شدید فشار خون می شود و این مسأله موجب پارگی شریان، خون ریزی و پرخونی بافت کبد و در نهایت آسیب بافت کبد می گردد(4). در مطالعه حاضر، آسیب وارد شده به ساختار بافتی کبد توسط زهر عقرب، توسط تیمار با سیکلوسپورین، تا حدودی کاهش یافته بنابراین در این پژوهش برای اولین بار از داروی سیکلوسپورین در عقرب گزیدگی Odontobuthus doriae استفاده شد و نتایج نشان داد این دارو قادر است روی شاخص های اصلی التهاب ناشی از عقرب گزیدگی تاثیر مثبت داشته باشد. نتایج این مطالعه مدعی است عملکرد سیکلوسپورین روی اینترلوکین-2، آلانین آمینوترانسفراز و آسپارتات آمینوترانسفراز و جلوگیری از پیشرفت آسیب بافت کبد تاثیر مثبت داشته و ممکن است باعث بهبود شرایط عمومی در عقرب گزیدگی شود. مطالعه مدل های موش باید هم چنان به ارائه بینش بر پایه ایمنی زهر شناختی آسیب کبد بپردازد و در نهایت منجر به توسعه استراتژی های ایمن سازی درمانی برای کاهش مرگ و میر و بیماری های مرتبط با گزیدگی شود.

تشکر و قدردانی

بدین وسیله مراتب سپاس و قدردانی خود را از تمامی عزیزانی که ما را در انجام این تحقیق یاری رساندند، به ویژه از کارکنان محترم بخش آزمایشگاه مرجع تحقیقات عقرب و بخش آسیب شناسی موسسه واکسن و سرم سازی رازی کرج و ریاست و دست اندرکاران محترم دانشکده علوم پایه دانشگاه آزاد اسلامی واحد دامغان اعلام می­نماییم. این مقاله از پایان نامه دکتری تخصصی این جانب استخراج گردیده است تا جهت جلسه دفاع به دانشگاه دامغان ارائه شود. پیشاپیش از بذل توجه شما کمال تشکر و قدردانی را دارم.

رضایت اخلاقی:

این مطالعه توسط کمیته رعایت اصول اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی، معاونت تضمین کیفیت، موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، سازمان آموزش و ترویج تحقیقات کشاورزی، کرج، ایران (شماره کد تأیید شده مجوز اخلاقی (RVSRI.REC.98.002) تأیید شده است.

1.Abbas, A.K., Lichtman, A.H., Pillai, S. (2018). Cellular and molecular immunology of Abol Abbas. ninth ed Tehran: Ebne-Sina & majd danesh Publishing House. 458-471.
2.Bawaskar, H.S., Bawaskar, P.H., (2000). Prazosin therapy and scorpion envenomation. The Journal of the Association of Physicians of India, 48(12);1175-80.
3.Chaubey, M.K. (2010). Consequences of Mesobuthus tamulus gangeticus (Pocock, 1900) envenomation in albino mice. The Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases, 16(3); 449-455.
4.Dehghani, R., Rafinejad, J., Fathi, B., Panjeh Shahi, M., Hashemi, A. (2017). A Retrospective study on scropionism in Iran (2002–2011). Journal of Arthropod-Borne Diseases journal, 11(2); 194–203.
5.D'Suze, G., Monceda, S., Gonzalez, C., Sevcik, C., Aguilar, V., Alagon, A. (2003). Relation ship between plasmatic levels of various cytokines, tumour necrosis factor, enzymes, glucose and venom concentrations following Tityus scorpion sting. Toxicon, 41; 367-375.
6.Elsayed, A.S.I., Bayomy, M.F.F., Azab, A.E. (2016). Effect of acute and chronic treatment of cyclosporine a on liver and kidney functions in rats. J Appl Pharm Sci, 6(03); 116–119.
7.Elsayed, A.S.I., Jbireal, J.M., Azab, A.E. (2018). Effect of acute and chronic cyclosporine a treatment on haematological data in male albino rats. Journal of Applied Biotechnology & Bioengineering, 5(6); 350‒357.
8.Fukahara, Y.D.M., Reis, M.L., Dellalibera-Joviliani, R., Cunha, F.Q.C., Donadi, E.A. (2003). Increased levels of IL-1b, IL-6, IL-8, IL- 10 and TNF-a in patients moderately or severely envenomed by Tityus serrulatus scorpion sting. Toxicon, 41; 49-55.
9.Institute of Standards and Industrial Research of Iran. (2008). Biological evaluation of medical devices-Part 2: Animal welfare Requirements. ISIRI, Part 2: 7216-7222. Available from: www.isiri.org. (5 Mar 2008).
10.Murthy Karl, R.K., Zolfaghrian, H. (1986). increased osmotic fragility of reid cells in dogs with acute myocarditis produced by scorpion (Buthus tamulus) Venom. Indian Journal of Physiology and Pharmacology, 30(3); 215-22.
11.Nair, A., Jacob, S. (2016). A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic and Clinical Pharmacy, 7(2); 27–31.
12.Ozkan, O., Adiguzel, S., Kar, S., Kurt, M., Yakistiran, S., Cesaretli, Y. (2007). Effects of Androctonus crassicauda (Olivier, 1807) (scorpiones: buthidae) venom on rats: correlation among acetylcholinesterase activities and electrolytes levels. Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases, 13(1); 69–81.
13.Ozkan, O., Bakir, F., Adiguzel, S. (2008). Effects of Androctonus crassicauda (Olivier, 1807) (Scorpiones: Buthidae) Venom on Rat Metabolism. Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases, 14(1); 45-57.
14.Petricevich, V.L. (2010). Scorpion venom and the inflammatory response. Mediators Inflamm. 2010 (2010); 1-17.
15.Petricevich, V.L., Peña, C.F. (2002). The dynamics of cytokine d nitric oxide secretion in mice injected with Tityus serrulatus scorpion venom. Mediators of Inflammation, 11(3); 173–180.
16.Petricevich, V.L., Navarro, L.B., Possani, L.D. (2013). Therapeutic use of scorpion venom. Molecular Aspects of Inflammation, 9; 209-231.
17.Rahravani, M., Ghadrdan Mashhadi, A., Rasooli, A., Razi Jalali, M., Mohammadian, B., Darvish Khadem, M. (2015). Histopathological study of Hemiscorpius lepturus venom injection in sheep. Iranian Veterinary Journal. 11(3); 124. 18.Rajasekaran, U.B., Nayak, U.S.K. (2014). How to choose drug dosage for human experiments based on drug dose used on animal experiments: A review. IJSS Case Reports & Reviews, 1(3); 31-32.
19.Ramakrishnan, M.A. (2016). Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology, 5(2); 559–574.
20.Razi Jalali, M., Jalali, M.T., Mapar, Z. (2015). Evaluation of plasma cytokine levels in mesobuthus eupeus (Scorpionida: Buthidae) scorpion envenomation in rats treated with polyvalent antivenom. Jundishapur Journal of Health Sciences. 7(1); 1-5.
21.Shaul Sofer, M.D., Eliezer Shahak, M.D., Moshe Gueron, M.D. (1994). Scorpion envenomation and therapy antivenom. The Journal of Pediatrics, 124(6); 973-978.
22.Shin, J.W., Seol, I.C. (2010). Interpretation of animal dose and human equivalent dose for drug development. The Journal of Korean Oriental Medicine, 31(3); 1-7.
23.Sperman, W.J., Karber, A.M., (1948). A method for obtaining and analyzing sensitivity data. J. Am. Statist. Assoc, 43; 109–126.
24.Vatanpour, H., Jalali. A., Rowan, E.G., Rahim. F. (2013). Effects of Odontobuthus doriae scorpion venom on mouse sciatic nerve. Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 12; 145-151.
25.World Health Organization. (‎1981)‎. Progress in the characterization of venoms and standardization of antivenoms. World Health Organization. (who offset publication No.58.) https://apps.who.int/iris/handle/10665/37282, 58; 1-44.
26.Zare Mirakabadi, A. (2013). Hemiscorpius lepturus envenomation: Manifestations and management with specific antivenom. Archives of Razi Institute, 68(2); 91-99.
27.Zare Mirakabadi, A., Mahmoodi Khatoonabadi, S., Teimoorzadeh, S. (2011). Antivenom injection time related effects of Hemiscorpius lepturus scorpion envenomation in rabbits. Archives of Razi Institute, 66(2); 139-145.
28.Zare Mirakabadi, A., Mahmoodi Khatoonabadi, S., Teimourzadeh, Sh., Sabiri, Gh.H. (2010). Serum enzymes studies in scorpion (Hemiscorpius lepturus) dose related envenomation in rabbits. Archives of Razi Institute, 65(2); 83-89.
29.Zare Mirakabadi, A.Z., Jalali, A., Jahromi, A.E., Vatanpur, H., Akbary, A. (2006).  Biochemical changes and manifestations of envenomation produced by Odonthobuthus doriae venom in rabbits. Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases, 12(1); 67-77.
30.Zayerzadeh, E., Fardipour, A., Zare Mirakabadi, A., Koohi, M.K. (2014). neutralizing effects of polyvalent antivenom on severe inflammatory response induced by Mesobuthus eupeus scorpion venom. Archives of Razi Institute, 69(2); 171-177.
31.Zayerzadeh, E., Zare Mirakabadi, A., Koohi, M.K. (2011). Biochemical and histopathological study of Mesobuthus eupeus scorpion venom in the experimental rabbits. Archives of Razi Institute, 66(2); 133-138.