بررسی تاثیر کوئرستین بر تکثیر و تمایز سلولهای بنیادی پیش ساز عصبی ناحیه زیر بطنی (svz) مغز رتهای بالغ.

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زیست شناسی جانوری، دانشکده علوم پایه، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران.

2 گروه زیست شناسی جانوری، دانشکده علوم پایه، واحد علوم و تحقیقات ، دانشگاه آزاد اسلامی،تهران، ایران.

3 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران.

چکیده

وجود سلولهای بنیادی پیش ساز عصبی در بخش هایی از مغز بالغین، امید به درمان و بازیابی نقص ها و بیماری های مرتبط با سیستم عصبی مرکزی و دژنراتیو مانند پارکینسون، آلزایمر و ام اس را بالا برده است. از طرفی کمک به تسریع تکثیر و تمایز این سلولها با دیدگاه درمانی بحث پیشرو دیگری است که این امیدها رابیشترمی کند. کوئرستین یک فلاونوئید گیاهی است که اثرات متعدد ترمیمی، مهاری و حفاظتی آن بر روی برخی از بیماری ها از جمله آسیب های عصبی، جبران استرس های اکسیداتیو، مهار سرطان و نیز روند های زیستی سلول از قبیل تمایز و تکثیر، بررسی و اثبات شده است. هدف از این تحقیق، بررسی تاثیر توام این ماده بر روند تکثیر و تمایز سلولهای زیر بطنی( SVZ) مغز موشهای بالغ در وضعیت وابسته به دوز می باشد
با استخراج سلولهای بنیادی عصبی از SVZ و تولید نوروسفیر، غلظتهای 1، 5 و 15 میکرومولارکوئرستین به محیطهای کشت افزوده شد. پس ازیک هفته تاثیر تکثیری و تمایزی آن با کنترل مقایسه گردید. بعد از تعیین هویت سلولی از طریق بیان ژن و وضعیت بقاء سلولی با آزمون MTT، شمارش و کمّی سازی تصاویر سلولی بوسیله نرم افزار ImageJ، معنی داری اختلافات از طریق نرم افزار SPSS بررسی گردید.
نتایج نشان داد که میزان تاثیر تمایزی در غلظت های مختلف متفاوت است. بطوریکه غلظت 1میکرومولار کمترین تاثیر تمایزی را دارد. از غلظت 5 میکرومولار و بالاتر، تاثیر تمایزی افزایش یافته ولی مهار تکثیر نیز اتفاق می افتد. در غلظت 15 میکرومولار بیشترین مهار مشاهده گردید.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

The study of the effect of quercetin on the proliferation and differentiation of neural stem cells of sub-ventricular zone (SVZ) in the adult rats

نویسندگان [English]

  • Ali Ebrahimi 1
  • Kazem Parivar 2
  • nasim hayati roodbari 3
  • Akram Eidi 3
1 Department of Biology, Faculty of Science, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran.
2 Department of Animal Biology, Faculty of Science, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran.
3 Department of Biology, Faculty of Science, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran.
چکیده [English]

The presence of neural precursor stem cells (NSCs) in some parts of the adult brains and the potency of these types of cells for the acceleration of the proliferation and differentiation processes with a therapeutic viewpoint is another beneficial facet of the application of neural precursor stem cells in cell biology. Quercetin, as an herbal flavonoid, has been extensively investigated and shown to have numerous effects on some cell-lines and disorders. We aimed to investigate the impact of quercetin, on proliferation and differentiation of NSCs derived from the subventricular zone (SVZ) of the adult rat brains. The isolated SVZs were mechanically minced into pieces through repeated pipetting in phosphate-buffered saline, incubated with 0.25% trypsin and treated with trypsin inhibitor; then centrifuged to obtain the cell suspension. The obtained cell suspension was cultured for one week to achieve neurospheres. When the cells reached confluence of 70-80%, they were sub-cultured for three passages and in the third passage, quercetin was treated with the cultured cells at the concentrations of 1, 5, and 15 μM. Methods such as Real time-PCR, MTT assay and ImageJ software, have been used to validate differentiation and proliferation of cells. The results indicated that the differentiation rate of NSCs is affected by various concentrations of quercetin in a dose-dependent manner so that 1µM quercetin had the least, and 15µM quercetin showed the most effects on cell differentiation. However, 1µM quercetin exhibited no significant cell toxicity, the most antiproliferative potential showed when treated with 15µM concentration quercetin.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Quercetin
  • Sub-Ventricular Zone (SVZ)
  • Differentiation
  • Proliferation

مقدمه

 

ترمیم آسیب های وارده به سیستم عصبی، به ویژه اعصاب مرکزی، همواره یکی از دغدغه های علوم بازساختی و پزشکی بوده است. هنوز بخش زیادی از این آسیب ها جبران ناپذیر هستند. بخشی از این نقص ها نیز منشاء درون زاد از قبیل فرسودگی و زایل شدن یا تخریب توسط سیستم ایمنی(اتوایمیون) دارند. تفکر غالب در دهه­های قبل عدم امکان جبران در این نقایص بوده است. اما با شناخت برخی روش های درمانی و ترمیمی امیدها برای جبران این قبیل آسیب ها بالاتر رفته است. از این میان شناخت منابع جبران سلولی مانند سلول های پیش ساز عصبی در نواحی درونی مغز از قبیل ناحیه زیر بطنی( SVZ) و هیپوکمپ به عنوان جدیدترین یافته ها، از اهمیت ویژه ای برخوردار است.برای یک ترمیم نورنی مناسب سه فرآیند مورد نیاز است. اول این که نورون آسیب دیده اطلاعات دقیق و به موقعی از میزان و مکان آسیب کسب نماید(4). دوم این که نورون آسیب دیده مجددًا از طریق حفظ تعادل میان عوامل تحریکی و مهاری به رشد مناسب و ذاتی خود دست یابد(16)، و سوم این که نورون آسیب دیده بتواند با کسب اطلاعات از محیط به اندام هدف متصل شده و کارکرد اولیه خود را بازیابد(13). با این دید هرکدام از این مراحل پیچیدگی های مختص به خود را داشته و با تاثیر پذیری از جنبه های مختلف امکان تسریع یا تقلیل را دارد. از طرف دیگر جبران بخشی از آسیب ها نیازمند وجود پیش سازهای مناسب و فراهم شدن امکان تکثیری و تمایزی آن ها می باشد. امروزه مشخص شده است که سلول های بنیادی/ پیش ساز عصبی(NSCs) در مغز پستانداران بالغ وجود داشته و در طول حیات به پویایی مغز آن ها کمک می کنند(6). دو ناحیه مهم نروژنیک در مغز پستانداران بالغ وجود دارد که سلول های بنیادی/ پیش ساز عصبی(NSCs) در آن ها ساکن هستند، یکی ناحیه زیر بطنی(SVZ) که در موقعیت جانبی بطن ها قرار دارد و دیگری ناحیه از شکنج دندانه دار هیپوکمپ(SGZ) می­باشد(2). بر اساس یافته های Chen و همکارانش( 2015)، خوش بینی در خصوص امکان استفاده از درون زایی(نوروژنز) سلول های پیش ساز عصبی در ترمیم مغز ایجاد گردید(8). از آن زمان یافته های فراوانی در این زمینه منجر به افزایش دانش بشری در خصوص سلول های بنیادی/ پیش ساز عصبی(NSCs) بالغین و درون زایی آن­ها شده است(7). کشف این سلول ها در سیستم عصبی مرکزی پستانداران که تا مدت ها تصور می شد فاقد هر گونه قدرت ترمیم و بازسازی هستند، امیدهای تازه ای را برای درمان بیماری های دژنراتیو سیستم عصبی مرکزی نظیر ام اس، پارکینسون، آلزایمر، سکته های مغزی و ضایعات نخاعی ایجاد کرده است(24). با این وجود هنوز روند بازسازی و ترمیم در سیستم عصبی مرکزی به عنوان بغرنج ترین مساله در علم پزشکی نوین و نیز علوم بنیادی مانند سلول درمانی و مهندسی بافت می باشد. به طوری که پایین ترین سطوح ترمیمی و بازساختی برپایه سلول های بنیادی هنوز در این سیستم اتفاق می افتد. امروزه استفاده از روش های تحریکی و استفاده از ترکیبات موثر بر روند تکثیر و تمایز در تسریع ترمیم و بازسازی یک امر مرسوم در علوم سلول درمانی و مهندسی بافت می باشد. کوئرستین از فلاونوئیدهای گیاهی است که به خاطر اثرات درمانی متعدد آن در سطح وسیعی از بیماری ها از قبیل اختلالات التهابی، قلبی- عروقی و سرطان بررسی شده است(9). هم­چنین تحقیقات اخیر که بر روی نقش و تاثیر حمایتی آن بر اختلالات و نقایص عصبی مانند پارکینسون و آلزایمر(10)، آسیب های مغزی و صدمات نخاعی تمرکز داشته اند(22). Russo و همکاران در 2012 دریافتند که کوئرستین از طریق جلوگیری از اکسیداسیون کلسترول دربرابر بیماری های قلبی عروقی محافظت می­کند. دریافت منظم رژیم غذایی غنی از کورستین در سالمندان مانع از CHD می شود. یافته های دانشمندان نشان می دهد که کوئرستین اثرات محافظتی در برابر بیماری­های قلبی عروقی مانند آترواسکلروز، ایسکمی حاصل ازآسیب های برگشتی، سمیت قلبی و فشار خون بالا را نشان می دهد(21). Guillermo Gormaz و همکاران، 2015 دریافتند اثر ضد التهابی کورستین نقش کلیدی در کاهش عوامل خطرساز قلبی عروقی مانند فیبرینوژن و پروتئین واکنشی C انسانی را دارد. بر اساس گزارش آن ها توانایی کوئرستین در مهارتکثیر و مهاجرت سلول های عضلانی صاف آئورت، تجمع پلاکتی همراه با مهار فسفوریلاسیون پروتئین MAP-کیناز، آن را به عنوان یک کاندید مناسب برای پیشگیری از اختلالات قلبی و عروق پیشنهاد می کند(12). Johari و همکاران، 2012 گزارش کردند که کوئرستین علیه طیف وسیعی از ویروس ها مانند ویروس T-lymphotropic انسان، Japanese encephalitis، و ویروس dengue virus type 2، از طریق خواص ضد عفونی کنندگی و ضد رونویسی آن موثر است. کوئرستین هم چنین ویروس هپاتیت C را با مسدود کردن فعالیت پروتئین NS پروتئاز مهار می کند(14). Ohnishi و همکاران، 2015گزارش دادند که کوئرستین علیه ویروس آنسفالومیوکاردیت و ویروس هرپس سیمپلکس با تقویت القای TNF و درنتیجه افزایش تولید IFN-β اقدام می کند(18). هم چنین مطالعات بیشتر در شرایط In vivo روشن کرده اند که کوئرستین علیه ویروس آنفلونزای A و ویروس porcine diarrhea epidemic، موثر است(18).  YueLiuو همکارانش (2017) که تاثیر کوئرستین را بر تکثیر و مهاجرت سلول های glioblastoma انسانی U251 بررسی کردند. به هر حال هنوز اطلاعات اندکی در خصوص مکانیسم های دخیل در این نقش های کوئرستین یافت شده است(28). تحقیق حاضر قصد دارد تا اثر کوئرستین را بر روی تکثیر و تمایز سلول های ناحیه زیر بطنی رت های بالغ در شرایط آزمایشگاهی بررسی کند.

مواد و روش ها

محلول تیمار

پودر زرد رنگ کوئرستین تهیه شده از شرکت سیگما آلدریچ در DMSO حل شده و با غلظت mol/L 0.1 به عنوان ترکیب ذخیره تهیه گردید. برای تهیه غلطت های مورد نیاز در زمان استفاده از محیط کشت به عنوان رقیق کننده استفاده و به میزان لازم محلول کاربردی تهیه شد.

محیط کشت

 DMEM/f12 ( Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham )،  (Sigma Aldrich) که به وسیله 4.5 g·L−1 glucose,FBS 10% fetal bovine serum (Gibco), و 1%  Penicillin streptomycin (Gibco), و فاکتورهای رشد bFGF EGF، تکمیل و هم آوری شده بود.

منبع سلولی و نحوه اخذ سلول

رت های لوئیس بالغ با وزن تقریبی 180 تا 200 گرم پس از تزریق درون صفاقی کتامین- زایلزین بی هوش و با کشیدگی و دررفتگی گردن کشته شدند و به سرعت مغز آن ها خارج گردید. مغز در داخل سرم فیزیولوژی حاوی پنی سیلین – استرپیتومایسین، در شرایط استریل جهت اخذ سلول های پیش ساز عصبی به شرح زیر تشریح گردید. ابتدا ناحیه لوب بویایی جدا شد. مغز با یک برش عرضی از سطح شکمی - میانی به دو قسمت  قدامی و خلفی تقسیم گردید. از ناحیه قدامی قسمت زیر بطنی، ابتدا تیغه میانی یا سپتوم دو بطن جداسازی شده و کنار گذاشته شد. سپس بدون برداشتن جسم مخطط و جسم پینه ای لایه نازکی از دیواره بطن طرفی برداشته و در یک پتری دیش حاوی pbs سرد قرار داده شد. جهت جداسازی سلول ها ابتدا با اسکالپل بافت حاصل کاملاً کوبیده و ریز شد. بافت قطعه قطعه شده با استفاده از سمپلر چندین بار پیپتاژ شده و سپس به درون فالکون 15 حاوی 3میلی لیتر تریپسین 02/0 درصد منتقل و به مدت 5دقیقه در دمای 37درجه نگه داری شد. سپس با افزودن محیط کشت به مقدار دوبرابر حجم تریپسین اثر آن خنثی شده و محتویات لوله جهت جداسازی سلول ها با دور 1500 و به مدت 3 دقیقه سانتریفیوژ گردید. محلول رویی دور ریخته و سلول های ته نشین شده به درون فلاسکT25 فیلتردار، حاوی محیط کشت منتقل گردید. پس از اطمینان از وجود سلول های در زیر میکروسکوپ(شکل1)، محیط کشت حاوی سلول به انکوباتور منتقل و در شرایط دمای 37 درجه سانتی گراد، CO2 5% و رطوبت کشت داده شد. پس از 4 روز از شروع کشت، اولین گروه سلول های نوروسفیر ملاحظه گردید(شکل2).

پاساژ سلولی

اولین پاساژ سلولی بعد از 13 روز از شروع کشت و با پرشدن فلاسک انجام گرفت(شکل3). و برای بار دوم نیز تکرار گردید. قطر مناسب نورسفیر ها برای انجام پاساژ به طور متوسط 150 میکرون می باشد(9) .

 تیمار با کوئرستین

 بعد از دومین پاساژ و یک دست شدن سلول ها، آن­ها به چهار گروه، شامل گروه کنترل(Co)، که محیط آن تنها شامل محیط کشت و ترکیبات حمایتی فوق بود(Q1)، حاوی محیط کشت، ترکیبات حمایتی و 1 میکرومولار محلول کوئرستین، (Q5)، حاوی محیط کشت، ترکیبات حمایتی و 5 میکرومولار محلول کوئرستین و (Q15)، که حاوی محیط کشت، ترکیبات حمایتی و 15 میکرومولار محلول کوئرستین بود، تقسیم گردید(14). تیمار با تعویض محیط کشت رویی به میزان 4میلی لیتر پس از هر 3، 2 و 2 روز تجدید شد. در پایان و پس از 7روز هویت یابی سلولی انجام و بررسی وضعیت تمایز و تکثیر با روش های PCR، MTTassey و آنالیز ظاهری با استفاده از نرم افزار ImageJ صورت گرفت. نتایج کمی و کیفی با استفاده از نرم افزار توسط نرم افزار SPSS ویرایش 20 و آزمون One way ANOVA و تست Tukey بررسی گردید و نتایج به صورت میانگین ± انحراف استاندارد بیان گردید. در تمامی آنالیزها مقادیر p<0.05 از نظر آماری معنی­دار(significant) در نظر گرفته شد.

هویت یابی سنجش بیان ژن، روشReal-Time PCR

با استفاده از روش PCR و بیان نستین و MAP2 پیش ساز عصبی بودن یا تمایز یابی به مرحله عصبی در سلول ها تایید شد. برای این منظور ، RNA کل سلول ها در هر چهار گروه با استفاده از دستورالعمل RNX-plus و Synagen جدا شد. پس از اطمینان از کیفیت RNA استخراج شده با روش الکتروفورز روی ژل آگارز و اسپکتروفتومتری برای آماده سازی cDNA، تک زنجیره­ای با 5/0 میکروگرم RNA با استفاده از آغازگرهای الگو(جدول 1) و آنزیم ترانس کریپتاز معکوس ادامه واکنش PCR با باز شدن اولیه 94 درجه سانتی گراد به مدت 2 دقیقه و چرخه های باز شدن 94 درجه سانتی­گراد به مدت 30 ثانیه، اتصال 55 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه، گسترش در 72 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه و 34 ثانیه. گسترش نهایی به مدت 5 دقیقه در دمای 72 درجه سانتی گراد انجام شد. پس از اتمام واکنش، 8 میکرولیتر از محصولات واکنش PCR توسط الکتروفورز ژل آگارز 5/1 % مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

 تکثیر و تمایز

 بقا سلولی با تست MTT  بررسی گردید. میزان تکثیر سلول ها با شمارش سلولی در هر یک از چهار محیط مختلف انجام شد. به طوری که مقدار 10 میکرو لیتر از سوسپانسیون سلولی را با 90 میکرولیتر تریپان بلو مخلوط نموده و مقدار 10 میکرولیتر از آن را بر روی هموسیتومتر منتقل و عمل شمارش سلولی انجام شد. برای تعیین میزان تمایز یابی از روی شکل ظاهری سلول ها نیز از نرم افزار ImageJ استفاده گردید. بدین صورت که بلندترین زایده سلولی به عنوان آکسون در نظر گرفته و تعداد و طول آن ها ملاک بر پیشرفت تمایز تلقی شد(5).

سنجش بیان ژن، روش Real-Time PCR

 بیان کمی mRNA ژن های عصبی مورد مطالعه در نمونه های حاصل از cDNA به دست آمده از سلول های کشت داده شده تحت شرایط تمایز عصبی بعد از یک هفته بررسی گردید. مراحل انجام آزمایش و نحوه ساخت مسترمیکس و برنامه دمایی واکنش مطابق دستورالعمل ذکر شده در کیت انجام گردید. اما به طور خلاصه ابتدا cDNA ساخته شده را با DEPC به نسبت 1به 2 رقیق کرده و سپس فلوسیتومتری انجام گرفت. تمام مراحل بر روی یخ اتفاق افتاد. بعد از آن به تعداد نمونه ها از هر گروه کشت در میکروتیوب جداگانه در محلول ترمال سایکلر قرار گرفت(جدول 2).

تحلیل آماری

اطلاعات به دست آمده جهت بررسی معناداری نتایج از طریق نرم توسط نرم افزار SPSS ویرایش 20 و آزمون One way ANOVA و تست Tukey بررسی گردید و نتایج به صورت میانگین ± انحراف استاندارد بیان گردید. در تمامی آنالیزها مقادیر p<0.05 از نظر آماری معنی دار(significant) در نظر گرفته شد.

نتایج

با توجه به محل اخذ سلول ها از موقعیت SVZ و انتظار پیش ساز عصبی بودن آن ها، نتایج RT-PCR بیان نستین را در همه آن ها تایید کرد(شکل 1،2،3). اما میزان بیان MAP2 مطابق با میزان تمایزیابی در چهار محیط طبق نمودار 1 متفاوت بود. زیرا MAP2 تنها در سلول های عصبی بالغ بیان می گردد. بر اساس این نمودار بیشترین سطح بیان در محیط Q15 مشاهده می گردد(شکل 4). نمودار 2 اطلاعات مربوط به میانگین طول آکسون های محاسبه شده توسط نرم افزار Image J می باشد. بر این اساس نیز بالاترین میزان تمایز یابی را در Q15 مشاهده می­شود. از نظر تکثیر، تفاوت معناداری بین گروه های کنترل وQ1 مشاهده نمی شود(نمودار 2). اما شمارش تعداد سلول ها به صورت تصادفی نشان از تاثیر مهاری تکثیر با افزایش دوز در محیط Q5 و بالاتر حالت کشندگی در محیط Q15 دارد(نمودار3). اختلاف این دو محیط با گروه شاهد معنا دار است. آزمون بقا(MTT assay) نیز این موضوع را تایید می نماید(نمودار4).

 

 

جدول 1- توالی پرایمرهای بکار رفته و اندازه آن ها.

 

Name

Sequences (5' → 3')

PCR fragment length (bp)

1

MAP2 forward

AGT TCC AGC AGC GTG ATG

97

2

MAP2 reverse

CAT TCT CTC TTC AGC CTT CTC

96

3

Nestin forward

GAA GGT GAA GGG CAA ATC TG

4

Nestin reverse

CCT CTT CTT CCC ATA TTT CCT G

 

جدول 2- مراحل واکنش Real-Time PCR اجرا شده برای بررسی بیان مارکرهای عصبی

مرحله

دما (درجه سانتی گراد)

زمان (ثانیه)

سیکل

دناتوره اولیه

95

30

1

دناتوره

95

5

45 - 30

اتصال آغازگر و گسترش

60

30

 

شکل 1- مشاهده اولین سلول های استخراج شده از SVZ.

 

 

 

 

 

 

 

شکل 2-اولین اجتماع نوروسفیر پس از 4 روز از شروع کشت.

 

 

شکل3-وضعیت نوروسفیرها در روز 13 پس از کشت.

 

 

 

 نمودار1-میزان بیان nestin و MAP2 در گروه های مختلف. هم چنان که مشخص است نستین در تمام گروه ها به صورت یکسان بیان شده است ولی MAP2 تفاوت معنی داری را در گروه ها نشان می دهد.

 

 

شکل 4 -الگوی بیان ژن در تصویر الکتروفورز.

 

 

نمودار2-مقایسه طول آکسون بر اساس میزان تمایز با استفاده از نرم افزار ImageJ. براین اساس نیز بیشترین تمایز یابی در محیط Q15  قابل مشاهده است.

 

 

 

 

 

شکل5- تصویر میکروسکوپ اینورت از وضعیت تکثیر و تمایز در سلولها در چهار محیط کشت متفاوت.

 

 

 

نمودار3- نمودار شمارش تصادفی سلولها در چهار محیط کشت. بر این اساس نیز تفاوت معناداری از نظر تکثیر در بین گروه کنترل و محیط های Q5 و Q15 مشاهده می شود.

 

 

 

 

نمودار 4- مقایسه میزان بقای سلولی با استفاده از آزمون MTT. مهار تکثیر در محیط با کوئرستین 5 و 15 میکرومولار معنادار است

.


بحث ونتیجه گیری


CHEN Ming-Ming و همکارانش(2015) تاثیر کوئرستین بر تمایز یابی عصبی در سلول های رده ی N1E-115 را در وضعیتی وابسته به دوز اثبات کردند. آن­ها مسیر مولکولی این تاثیر را وابسته به افزایش غلظت cAMP دانستند. بر اساس مطالعات قبلی مشخص شده است cAMP در فرآیند بازسازی عصبی از طریق تنظیم بیان پایین دستی ژن Gap-43 دخیل است. این تنظیم از طریق مسیر سیگنال cAMP. IL-6 به گیرنده مربوطه متصل می­شود و Janus kinase (JAK) را فعال می کند و سپس STAT3 فسفریله شده و با ورود به هسته Gap-43 را بیان می کند. از آن جائی که Gap-43 در باز آرایی اکتین دخیل است، افزایش بیانی آن باعث رشد و افزایش طول آکسون می گردد. اما آن چه مطالعات نشان داده است این است که mRNA مربوط به Gap-43 در آکسون موجود نیست و برای فراهم شدن میزان کافی از آن به طور متوسط 3 روز زمان لازم است. بر اساس یافته های آن ها کوئرستین در غلظت 10 میکرومول بر لیتر به میزان بالایی بیان cAMP را پس از دوساعت و بیان Gap-43 را پس از دو روز شروع تیمار، افزایش داد(7). Chen Ming-Ming و همکارانش (2015) تاثیرمثبتی را از نظر تکثیر وابسته به غلظت کوئرستین از روز 4 به بعد در این لاین سلولی گزارش نکردند(8). بر اساس یافته های ما نیز تاثیر تمایزی کوئرستین بر روی سلول های بنیادی عصبی با منشا SVZ مورد تایید قرار گرفت ولی بیشترین تاثیر تمایزی در روز 13 دیده شد وپس از آن بدون تغییر باقی ماند. این تفاوت زمانی نیز می تواند به دلیل نوع سلول ها و نیز روش تولید سلول های پیش ساز عصبی از طریق مسیر تولید نوروسفر باشد(7). بر اساس یافته های YueLiu و همکارانش (2017) که تاثیر کوئرستین را بر تکثیر و مهاجرت سلول های glioblastoma انسانی U251 بررسی کردند(28). اثر مهاری آن در وضعیت وابسته به زمان و دوز مورد تایید قرار گرفت. بر اساس یافته های آنان کم ترین سطح غلظتی لازم برای بروز مهار تکثیر این رده ی سلولی در غلظت 20 میکروگرم بر میلی لیتر به مدت 48 ساعت گزارش گردید. در حالی که سطوح غلظتی کمتر بدون تاثیر مهاری و دارای اثر تکثیری می باشد. تاثیر مهاری این ماده در تحقیق ما نیز با غلظت 15 میکروگرم بر میلی لیتر از رو هفتم قابل تمیز بوده و تا روز 13 بدون تغییر نشان داد. دلیل اثر مهاری این فلاونوئید بر تکثیرسلول ها، بر اساس یافته های Ilary و همکاران، از مسیر مولکولی Bax/Bcl2 می باشد(13). Bax و Bcl-2 دو عضو اصلی خانواده Bcl-2 هستند که نقش اساسی در پیشرفت تومور دارند. Bax، مولکول پیش برنده آپوپتوز از طریق نفوذپذیر کردن غشای خارجی میتوکندری در پاسخ به تنش های مختلف سلولی است که باعث مرگ سلول می شود. در مقابل، Bcl-2 به عنوان یک عضو اصلی ضد آپوپتوز عمل می کند و با مهار فعالیت Bax از آپوپتوز جلوگیری می کند. Bax می تواند با Bcl-2 همودیمر یا هترو دایمر ایجاد کند. وقتی غلظت Bcl-2 در سلول ها زیاد باشد، Bax تمایل به تشکیل هترو دایمر دارد، و این یک سیگنال زنده ماندن برای سلول ها است. در مقابل، وقتی سطح Bax افزایش یابد ، همودیمر ایجاد می کند و باعث افزایش آپوپتوز سلول می شود. این بدان معنی است که نسبت Bax به Bcl-2 حساسیت سلول به آپوپتوز را تعیین می کند. در یافته های آن ها مشخص شد که نسبت Bcl-2 / Bax در تیمار با کوئرستین، در 10 میلی گرم در میلی لیتر کاهش یافته است. پس در نتیجه کورستین احتمالاً با تعدیل سطح Bcl-2 باعث مرگ سلولی می شود. جالب توجه است که اخیراً نشان داده شده است که کورستین مستقیماً به حوزه BH3 پروتئین های Bcl-2 و Bcl-xL در سلول های Jurkat انسانی متصل می­شود. مطالعه ساختاری نشان داده است که کوئرستین به روشی مشابه با آنتاگونیست تقلیدی BH3 به Bcl-xL متصل می شود که شواهدی برای مکانیسم بالقوه آپوپتوز ناشی از کوئرستین را ارائه می دهد. هم چنین آن ها کاهش بیان MMP2 و MMP9 را به عنوان عوامل پیش برنده سرطان در سلول های تیمار شده با کوئرستین اثبات کردند(28). Nakajima و همکارانش(2016) اعلام کردند که کوئرستین تمایز یابی سلول های رده ی PC12 به عصبی را تحریک می کند. آن ها دلیل این عملکرد کوئرستین را از طریق فعال کردن کوترانسپورتر Na/K/2Cl معرفی کردند(15). بر اساس یافته های این پژوهش نیز غلظت های 5 میکرومولار و بالاتر کوئرستین تمایز یابی سلولهای SVZ را تسریع می کند. Palazzolo و همکارانش(2012) ابراز داشتند که فلاونوئید ایزوکوئرستین تطویل زواید نورونی را از طریق کاهش فعالیت RhoA افزایش می دهد(19). با کنار هم قرار دادن این اثرات به همراه برخی دیگر از مهم ترین تاثیرات کوئرستین مانند تاثیر آنتی اکسیدانی(  Alrawaiq و همکارانش؛  2014 (3) ،  Ademsun؛ 2015 (1) و  Robazkiewic همکاران؛ 2009 (20)) و تاثیر ضد التهابی Zhang و همکاران؛ 2011 (29)، Testa و همکاران، 2014 (27)، Sun وهمکاران؛ 2015(25)، Sharma، 2007 (23)و ...) می توان این ماده را به عنوان یکی از مهم ترین ترکیبات دارویی در تسریع ترمیم آسیب های عصبی که همراه با شرایط استرس سلولی از جمله التهاب و حضورگروه های اکسیداتیو می باشد، پیشنهاد کرد. این وضعیت در برخی از بیماری های دستگاه عصبی مرکزی مانند: تروما، M.S. ، آلزایمر و پارکینسون بسیارشایع است

1.Ademosun, A.O., Oboh, G., Bello, F., Ayeni, P.O. (2015). Antioxidative properties and effect  of quercetin and its glycosylated form (Rutin) on acetylcholinesterase and but yryl cholinesterase activities, J. Evid. Based Complementary Altern. Med. 4 (2015), doi:http://dx.doi.org/10. 1177/2156587215610032.
2.Allison, M., Bond, M., Hongjun, S. (2015). Adult mammalian neural stem cells and neurogenesis: five decades later. Cell Stem Cell, 17(4); 385–395.
3.Alrawaiq, N.S., Abdullah, A. (2014). A review of flavonoid quercetin: metabolism:bioactivity and antioxidant properties. Int.J. PharmTech Res, 6; 933–941.
4.Ambron, RT., Walters, ET. (1996). Priming events and retrograde injurysignals. A new perspective on the cellular and molecular biology of nerve regeneration, [J]. Mol Neurobiol, 13(2); 61-79.
5.Boots, AW., Haenen, GR., Bast, A. (2008). Health effects of quercetin: from antioxidant to nutraceutical. [J]. Eur J Pharmacol, 585(2-3); 325-337.
6.Bischoff, SC. (2008). Quercetin: potentials in the prevention and therapy of disease. [J]. Curr Opin Clin Nutr Metab Care, 11(6); 733-740.
7.Chen, M., Yin. Z., Zhang, L., Liao, H.(2015). Quercetin promotes neurite growth through enhancing  intracellular cAMP level and GAP-43 expression. Chinese Journal of Natural Medicines, 13(9); 0667-0672 .
8.Chen, ZL., Yu, WM., Sidney, S. (2007). Peripheral regeneration. [J]. Annu  Rev Neurosci, 30; 209-233.
9.Cho, JY., Kim, IS., Jang, YH. (2006). Protective effect of quercetin, a natural flavonoid against neuronal damage after transient  global cerebral ischemia. [J]. Neurosci Lett, 404(3); 330-335.
10.Dajas, F., Rivera-Megret, F., Blasina, F. (2003). Neuroprotection by flavonoids, [J]. Braz J Med Biol Res, 36(12); 1613-1620.
11.Golmohammadi, MG., Sagha, M., Azari, H., Najafzadeh, N. (2011). Isolation of neural stem and progenitor cells from the adult mouse brainusing the neurosphere assay. Journal of Ardabil Univ Med Sci, 11(3); 246-258.
12.Guillermo Gormaz J., S. Quintremil, R. (2015). Cardiovascular disease a target  for the pharmacological effects of quercetin. Curr. Topics Med. Chem.,15;1735–1742.
13.Ilary, A., Esther, U., Xavier, N. (2012). Specificity of peripheral nerve regeneration: Interactions at the axon level. [J]. Prog Neurobiol. (2); 98- 106.
14.Johari, J., Kianmehr, A., Mustafa, M.R., Abubakar, S., Zandi, K. (2012). Antiviral activity of baicalein and quercetin against the Japanese encephalitis virus. Int. J. Mol. Sci.,13; 16785–16795.
15.Nakajima, K.I., Niisato, N., Marunaka, Y. (2011). Quercetin stimulates NGF-induced neurite outgrowth in PC12 cells via activation of Na+/K+/2Cl-cotransporter. Cell.  Physiol. Biochem., 28;147–156.
16.Namiko, A., Valeria, C. (2008).Nerve injury signaling. [J]. Curr Opin Neurobiol, 18(30);276-283.
17.Natarajan, S., Pandima, D. K., Nabavi, Se. F. (2011). Bioactive effects of quercetin in the central nervous system: Focusing on  the mechanisms of actions. Journal of Ardabil Univ Med. Sci, 11(3); 246-258.
18.Ohnishi, H., Sato, M., Ohnishi-Kameyama, M., Matsunaga, I., Naito, S. (2015). Estimated daily intake and seasonal food sources of quercetin in Japan. Nutrients, 7; 2345–2358.
19.Palazzolo, G., Horvath, P., Zenobi-Wong, M. (2012). The flavonoid isoquercitrin promotes neurite elongation by reducing RhoA activity. PLoS One, 7;e49979.
20.Robaszkiewicz, A., Balcerczyk, A., Bartosz, G. (2007). Antioxidative and prooxidative effects of quercetin on A549 cells. Cell. Biol. Int., 31; 1245–1250.
21.Russo, M., Spagnuolo, C., Tedesco, I., Bilotto, S., Russo, G.L. (2012). The flavonoid quercetin in disease prevention and therapy: facts and fancies. Biochem. Pharmacol, 83; 6–15.
22.Schültke, E., Kamencic, H., Zhao, M. (2005). Neuroprotection following fluid percussion brain trauma: a pilot study using quercetin. [J]. J Neurotrauma, 22(12); 1475-1484.
23.Sharma, V., Mishra, M., Ghosh, S., Tewari, R., Basu, A., Seth, P. (2007). Modulation of interleukin-1b mediated inflammatory response in human astrocytes by flavonoids: implications in neuroprotection. Brain Res. Bull, 73; 55–63.
24.Shu-Ting, Ch. (2014). Oral and intraperitoneal administration of quercetin decreased lymphocyte DNA damage and plasma lipid peroxidation induced by TSA in vivo. BioMed Research International, 1155(10); 2133-2143.
25.Sun ,G.Y., Chen, Z., Jasmer, K.J., Chuang, D.Y., Gu, Z., Hannink, M. (2015). Quercetin attenuates inflammatory responses in BV-2 microglial cells: role of MAPKs  on the nrf2 pathway and induction of heme oxygenase-1. PLoS One, 10;e0141509.
26.Taupin, P. (2011). Neurogenesis, NSCs, pathogenesis and therapies for lzheimer's disease. Front Biosci., (Schol Ed) 3; 178-190.
27.Testa, G., Gamba, P., Badilli, U., Gargiulo, S., Maina, M., Guina, T. (2014). Loading into nanoparticles improves quercetin's efficacy in preventing neuroinflammation induced by oxysterols. PLoS. One., 9;e96795.
28.Yue, L., Zhen-Gang, T., Yi, L., Xin-Guo, Qu., Wei, L., Guo-Bin, Wang, C. (2017). Effects of quercetin on proliferation and migration of human glioblastoma U251 cells. Biomedicine & Pharmacotherapy, 92;33–38.
29.Zhang, M., Swarts, S.G., Yin, L., Liu, C., Tian, Y., Cao, Y. (2011). Antioxidant properties of quercetin oxygen transport to tissue XXXII. Springer, 283–289