نوع مقاله: مقاله پژوهشی
نویسنده
عضو هیات علمی دانشگاه آزاد اسلامی زنجان
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسنده [English]
Proteus is a gram negative and facultative anaerobic opportunistic pathogen. This bacterium is responsible for 10% of urinary tract infections. A cause of 90% of proteus-induced infection is the mirabilis. Increasing the multi-drug resistance and the side effects of antibiotics have led to a special concern for this purpose, finding preventive strategies like making a vaccine seems essential. In the present study, LPS from Proteus mirabilis, was extracted, detoxified and conjugated to PLGA nanoparticle. This conjugation was confirmed with ZetaSizer, FTIR and AFM. Vaccination was done intramuscularly, 3 times in two weeks intervals. Then, mices were anesthetized and operated with ethical rights and 6×107 CFU concentrations of P.mirabilis was injected into their bladder. After one week of injection, bladders were removed and suspended in a salt buffer.The results of the challenge test confirmed the success of the PLGA-LPS conjugate in comparison with other groups. In other words, the control and PLGA groups had the highest growth rates, and the average number of colonies was significantly higher than all of the groups. And the number of colonies grown in groups were LPS-PLGA(6.2 *10 cfu/ml) , LPS(3.6 ×103 cfu/ml), PLGA (91.3×102 cfu/ml) and NS(98 × 102 cfu/ml). According to one-way ANOVA, which was done by SPSS software, there was a significant difference between all groups (P <0.05).the PLGA immunogenicity was significantly different with the control group. Therefore, it can be concluded that the PLGA-LPS conjugate has an appropriate immunity and can be a candidate of nano-vaccine for urinary tract infection of P.migrailitis.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه
پروتئوس میرابلیس، باکتری میله ای، گرم منفی از خانواده ی انتروباکتریاسه، با حرکت سوارمینگ و فعالیت اوره از مثبت است(36،37،40،49). در واقع، توانایی خزیدن روی آگار وتشکیل کلنی‌های بسیار منظم و تراس(لبه) دار که ظاهر bulls-eye را دارند، از جمله ویژگی های برجسته ی این باکتری است. خزیدن این باکتری در نتیجه تمایزهای دوره ای سلول های رویشی به سلول های خزنده است(32). ممکن است ترکیباتی مانند پلی ساکاریدها(مانند لیپوپلی ساکارید (LPS، ترکیبات ماتریکس خارج سلولی و اسید های چرب نیز در خزیدن پروتئوس میرابیلیس تاثیر بگذارند(16). این باکتری یکی از علل شایع عفونت های ادراری است(7). گرچه درمان اولیه برای عفونت دستگاه ادراری، پیشگیری مداوم با آنتی بیوتیک ها است. اما مقاومت چند دارویی باکتری ها نسبت به آنتی بیوتیکها واز طرف دیگر، عوارض جانبی مصرف آنتی بیوتیک ها و شیمی درمانی افزایش یافته است(24). از این رو، جستجوی راه های پیشگیرانه و موارد تقویت کننده ی سیستم دفاعی بدن، همانند واکسن، ضروری به نظر میآید.طی دهه های گذشته، واکسیناسیون دستخوش تحولی عظیم قرار گرفته است. با پیشرفت بیوتکنولوژی، دنیای علمی حاضر شاهد ظهور سیستم تحویل واکسن نوینی، به نام نانوواکسن ها بوده است، که در مقایسه با استراتژی های واکسیناسیون معمول موجب ایمنی هومورال، سلولی و مخاطی می شوند. بسیاری از نانوواکسن های مجاز برای استفاده ی انسانی، حامل هایی موثر برای آنتی ژن ها محسوب می شوند. نانوذرات پلیمری، حامل هایی کلوئیدی به اندازه ی 1000-10 نانومتر هستند، که عمدتاً شامل پلیمرهای زیست تخریب پذیر می باشند(45). ترکیبات پلیمریک از قبیل پلی لاکتیک گلایکولیک اسید(PLGA) به تازگی پتانسیل قابل توجهی را در ایفای نقش ادجوانت واکسن‌ها به عنوان رساننده آنتی‌ژن به علت توانایی‌شان در زیست تخریب‌پذیری، احتساب آنتی‌ژن‌ها و رهایش کنترل شده آنها از خود نشان داده اند(33). PLGA معمولاً در چرخه های سلولی اختلالی ایجاد نمی کند و زمان قرارگیری دارو بر روی سلول و مسیر اندوسیتوزی را کاهش می دهد. در واقع در یک جمله می توان گفت که این نانوذرات سدهای بیولوژیک را در می نوردند(12).آنتی ژنیک بودن LPS دلیلی است که میتوان از آن برای تحریک سیستم ایمنی بدن و تولید واکسن بهره جست(24،53). اما واکسن های پلیساکاریدی در فعال کردن سلول های Th ناتوان هستند و فقط سلول های B را به صورت مستقل از T فعال میکنند، یک راه جهت تحریک مستقیم سلول های Th در پاسخ به آنتی ژن های پلی ساکاریدی، کونژوگه کردن آنتی ژن با انواعی از حامل ها است(4). از این رو به منظور ایمنی زایی در برابر عفونت های ادراری ناشی از پروتئوس میرابلیس بر آن شده تا واکسنی متشکل از کونژوگه ی PLGA-LPS را طراحی و ایمنی زایی آن را در مقایسه با LPS در مدل موشی بررسی گردد. چندین فاکتور ویرولانس در بیماری زایی پروتئوس میرابلیس عنوان شده اند که عبارتند از:
• هیدرولیز اوره به وسیله آنزیم اوره آز
• سمیت سلولی به وسیله همولیزین
• جلوگیری از دفاع میزبان به وسیله ی پروتئاز ایمونوگلوبین A
• تخزیب سلول های اپی تلیال کلیه به وسیله تهاجم
• حرک سوارمینگ به وسیله فلاژل
• چسبندگی به سلول های اپی تلیال دستگاه ادراری و اپیتلیوم کلیه به وسیله فیمبریا و سایر چسبیدگیها (13).
پروتئوس میرابلیس، مسئول ایجاد 90 درصد عفونتهای ناشی از پروتئوس می باشد و می تواند به عنوان یک عفونت همه گیر محسوب شود(43). این باکتری می تواند موجب عفونت هایی چون عفونت دستگاه تنفسی، پوست و باکتریمی گردد(44). پروتئوس میرابلیس بر روی کاتتر های ادراری قرار گرفته و با ایجاد بیوفیلم، باعث تشکیل پوسته ای روی کاتتر(سوند ادراری) و مسدود شدن آن در طول عفونت های ادراری میشود و تعداد زیادی از بیماران دارای کاتتر در بیمارستان ها را آلوده می کند. این عفونت معمولاً توسط تجهیزات پزشکی ازجمله سوند(کاتتر)، مرطوب ساز(نیبولایزر ،مسئول استنشاق)، دستکش معاینه(عفونت زخم) به بیمار منتقل می شود(47،48). علاوه بر این، نه تنها موجب سیستیت و پیلونفریت حاد می گردد، بلکه موجب سنگ های ادراری، خصوصاً در افراد با دستگاه ادراری غیر طبیعی نیز می شود. لذا، نگرانی ویژه ای به عنوان عامل عفونت های بیمارستانی ،به ویژه با ظهور سویه های مقاوم چند دارویی(MDR)، محسوب میشود(39،38، 29). کاهش حساسیت پروتئوس میرابلیس به ایمی‌پنم و مقاومت به پلی مکسین ها، تتراسایکلینها(از جمله تیگیسایکلین) و بتا-لاکتام، موجب محدودیت جدی در گزینه های درمانی شده است(5).
لیپوپلی سارکارید(LPS)
لیپو پلی ساکارید، آنتی ژن باکتریایی سطحی اصلی و غشای خارجی بوده و شامل شمار متعددی از فعالیت های بیولوژیکی، از جمله اثرات پاتوفیزیولوژیکی است(31،32). LPS و پلی ساکارید های دارای خصوصیات کپسول، نقش مهمی را در عفونت زایی و ایجاد سنگ کلیه و مثانه ایفا می کنند(31،32). LPS، یک گلیکولیپید پلی آنژیونی با بار منفی است که از 4 ناحیه ی مرتبط تشکیل شده است که موجب آمفی پاتیک و قطبی شدن آن می شود(50). این مناطق شامل لیپید A، هسته داخلی، هسته خارجی و آنتی ژن O سوماتیک است(21). سیستم های تحویل داروی کلوئیدی با ماهیت لیپیدی( لیپوزوم، الاستیک لیپوزوم، اتوزوم، میکرو امولسیون، نانوامولسیون) و پلی مری( نانوذرات پلی مری) از نظر انتقال مواد فعال زیستی(سنتتیک، طبیعی یا در نتیجه ی بیوتکنولوژِی)، با تمرکز بر افزایش قابلیت زیستی دارو، تحویل تحت کنترل به منطقه خاص و کاهش سمیت مورد بررسی قرار گرفته اند. با وجود ویژگی های جالب به دلیل عدم پذیرش موقعیت مواد جانبی و مسائلی که در خطوط تولید و طراحی برای تولید مقیاس زیاد وجود دارد، محصولات مبتنی بر نانوذرات پلی مری را در بازار نمیتوان یافت. در حالی که سیستم های حامل مبتنی بر لیپید به دلیل استفاده از چربی ها و روغن های طبیعی و پذیرش از نظر دارویی به طور قابل توجهی افزایش یافته اند(33). نتایج مطالعاتی که گاگنهیم(2009)، یاه(2007)، گالس(2002)، واگنلنر(2002) و همکارانشان بر روی گونه های پروتئوس انجام داده اند، بیانگر مقاومت اکثریت آن ها به سپروفلوکساسین است(15،28،49). نتایج بررسی ایشیل و ساتوک(1991) نشان دهنده ی مقاومت اکثر باکتری های پروتئوس ولگاریس به اوفلوکساسین، به علت کاهش تولید پورین، حساسیت کامل(100%) پروتئوس میرابلیس به آمیکاسین، نالیدیکسیک اسید، سیپروفلوکساسین، پلی میکسین B و نئومایسین، حساسیت 80 درصدی نسبت به اوفلوکساسین و کلیستین، حساسیت 20 درصدی به جنتامایسین و مقاومت به کانامایسین، سفتازیدیم، اوگزاسیلین، آمپی سیلین، تتراسایکین و کلیندامایسین می باشد(24).
نانوذرات پلی مری
نانوذرات پلی مری دارای مزایایی بیش از میکرو ذرات هستند. این نانومواد دارای ظرفیت بارگذاری بالای دارو بوده و در نتیجه تحویل داخل سلولی را افزایش داده و برای تحویل داخل وریدی گزینه مناسبی هستند. در 25 سال اخیر، پلی مرهای سنتتیک زیست تجزیه پذیر به دلیل زیست سازگاری و زیست تجزیه پذیری که دارند به صورت های گوناگون در ساخت عوامل مولکولی تصویر بردار و سیستم های تحویل دارو و ژن مورد استفاده قرار گرفته اند(25). خصوصاً نانوذرات پلیمری، به نام پلی لاکتیک کوگلایکولیک اسید(PLGA)، یکی ازتوسعه یافته ترین پلیمرهای زیست تخریب پذیر هستند که به خاطر خواص جذابی که دارند به طورگسترده‌ای در اهداف دارورسانی، به عنوان سیستم های دارورسان در زمینه های مختلف بیوپزشکی مثل واکسیناسیون، التهاب و سایر بیماری ها مورداستفاده قرار می گیرند(20). این پلیمر دارای خصوصیاتی نظیر زیست سازگاری و زیست تخریب پذیری بوده و از طرف دیگر بسته به ساختار شیمیایی آن پایداری مناسبی در محیط زیستی دارد. به علت عدم آب دوستی PLGA، اتصال سلول ها به PLGA اغلب به خوبی صورت نمی‌گیرد(10). در پژوهش های انجام شده مشخص گردیده که سیستم دارورسانی خوراکی نانوذره ای برای بسیاری از کاربردهای مختلف از قبیل دارورسانی خوراکی عوامل شیمی درمانی برای درمان سرطان، رساندن موضعی دارو به روده برای درمان بیماری IBD و واکسیناسیون خوراکی موکوسی در حال توسعه است. پروتئین های زیادی، به ویژه انسولین برای درمان دیابت، در نانوذرات برای استفاده به صورت خوراکی بارگذاری شده اند. توسعه موفقیت آمیز نانوذرات برای روش خوراکی می تواند الگوی درمانی بسیاری از بیماری ها را تغییر دهد و تأثیری مهم روی نتایج درمانی در آینده داشته باشد(3).گاندر و همکاران (2006) نشان دادند کهPLGA دراتصال با پلی اتیلن گلیکول( PEG) و سوکسینامید(NHS) بهترین گزینه برای اعمال کونژوگاسیون این نانوذره با سایرترکیبات است(One-step preparation of polyelectrolyte-coated PLGA microparticles)(28). در تحقیقی که در سال 2011 انجام شد نیز، PLGA به عنوان حامل مناسب برای انتشار تسهیل یافته آنتی ژن ها با قابلیت لیگاند شدن اختصاصی با مولکول های هدف و افزایش معنا دار پاسخهای ایمنی مورد استفاده قرار گرفته است(15).
مواد و روش ها
دراین روش ازموش سوری ماده 6 الی 8 هفته با وزن 30-20 گرم به عنوان حیوان آزمایشگاهی استفاده شد. باکتری پروتئوس میرابلیس از موسسه انیستیتو پاستور تحویل گرفته شد و در محیط تریپتیک سوی آگار ساب کالچر گردید. نانوذره PLGA در بسته تجاری 5 میلیگرمی با قطر متوسط 500 نانومتر و حمل در یخ مرطوب و دمای ذخیره سازی21- درجه سانتی گراد از شرکت سیگما آلدریچ خریداری شد. جهت اطمینان از سلامت باکتری پروتئوس میرابلیس خریداری شده آن را در محیط بلادآگار کشت داده و 24 ساعت در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی گراد قرار گرفته، سپس محیط از نظر رشد و سوارمینگ بررسی گردید. از محیط تریپتیک سوی آگار جهت کشت باکتری و از محیط تریپتیک سوی براث جهت تخلیص مراحل LPS استفاده شد. که پس از ساخت تریپتیک سوی براث ارلن های آماده شده در اتوکلاو قرار داده و پس از تلقیح باکتری به یک ارلن 300 سی سی در دمای 37 درجه و دور 61 rpm به مدت 72 ساعت در اتوشیکر قرار گرفت(31،35)
استخراج و تخلیص آنتی ژن لیپو پلی ساکاریدی(LPS )
پس از خارج کردن از اتوشیکر به هر ارلن 5/0 سیسی فنول 90 %اضافه و در بن ماری 50 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه قرار گرفت. سپس محلول فوق با دور 2500 rpm به مدت 30 دقیقه سانتریفوژ و رسوب برای مرحله بعد نگهداری و اندازه گیری شد. به ازای 16 گرم رسوب 75 سی سی آب مقطر استریل شده اضافه گردیده و داخل بن ماری به مدت 30 دقیقه در دمای 66 درجه سانتی گراد 75 سی سی فنول که حجم ثابتی دارد به محلول فوق اضافه گردید و به مدت 30 دقیقه در دمای 66 درجه سانتی گراد قرار داده شد. عمل سرد کردن محلول در آب یخ به مدت 30 دقیقه انجام و جهت جدا کردن فاز آبی محلول فوق با دور rpm2500 به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ گردید پس از سانتریفوژ و جداسازی فاز آبی محلول ها یکی شدند. در مرحله بعد حجم محلول اندازه گیری و نصف حجم محلول اتانول 96% اضافه و به مدت 24 ساعت در یخچال در دمای4 درجه سانتی گراد قرار داده شد. پس از گذشت 24 ساعت محلول فوق با دور 2500 rpm به مدت 30 دقیقه سانتریفوژ گردید و رسوب حاوی پروتئین حذف شد. سپس برابر با حجم محلول 3 برابر اتانول 96% اضافه و به مدت 24 ساعت در یخچال در دمای 4 درجه سانتی گراد قرار گرفت. پس از گذشت 24 ساعت محلول ها جهت جداسازی رسوب LPS با دور rpm2500 به مدت 90 دقیقه سانتریفوژ گردیدند(27،52)
دتوکسیفه کردن آنتی ژن لیپوپلی ساکاریدی(D-LPS)
در این مرحله ابتدا از محلول NaOH 2/0نرمال در لوله ی حاوی رسوب LPS به اندازه ای ریخته می شود که فقط رسوب حل شود. سپس محلول فوق را 3 ساعت در بن ماری جوشان با دمای 80 درجه سانتی گراد قرار داده و پس از مدت زمان فوق pH آن را روی 7 توسط NaOH و HCl تنظیم و جهت خالص سازی LPS عمل دیالیز انجام می گیرد(30).
دیالیز و خالص سازی آنتی ژن لیپوپلی ساکاریدی دتوکسیفه شده
ابتدا محلول مرحله ی قبل که pH آن تنظیم شده بود داخل کیسه های دیالیز با قطر 10 کیلو دالتون ریخته و داخل تنگ حاوی آب مقطر دیونیزه به همراه یک مگنت روی همزن برقی در دمای 4 درجه سانتی گراد به مدت 4 روز قرار داده شد، پس از اتمام این مدت محلول ها را یکی کرده و 3 برابر حجم آن اتانول مطلق اضافه گردید و به مدت 24 ساعت در دمای 4 درجه سانتی گراد قرار داده شد و روز بعد سانتریفوژ با دور2500 rpm به مدت 60دقیقه انجام شد و رسوب حاویLPS-D دیالیز شده جدا و آب اضافی گرفته شده و در داخل میکروتیوب ها در دمای 18 - درجه سانتی گراد قرار گرفت (26).
کونژوگاسیون LPS با PLGA
مراحل کونژوگاسیون در آزمایشگاه کنترل کیفی اداره کل انتقال خون زنجان انجام شد که به شرح زیر میباشد:
درون دو بالن ژوژه ی100میلی لیتری یک مگنت قرار داده شد و تقریباً 5 میلی لیتر از حلال DMFO ریخته شد، سپس 200 میلی گرم از PLGA به درون حلال اضافه گردید. 10 دقیقه زمان برای حل شدن PLGA ها داده شد. سپس 200 میلی گرم EDC و 50 میلی گرم EDC همزمان به داخل ظرف ریخته شد. بعد از گذشت 5 دقیقه، آنتی ژن LPS به مقدار 400 میلی گرم به داخل ظروف و بر روی بقیه مواد اضافه و به مدت یک هفته در دمای آزمایشگاهی به منظور انجام واکنش استریفیکاسیون و تشکیل کونژوگه ی PLGA با لیپو پلیساکارید و تشکیل این پیوند استری روی شیکر نگهداری شد. بعد از یک هفته کونژوگه آماده نگهداری درون یخچال شدکه به منظور تخلیص و جداسازی ماکرومولکول کونژوگه بعد از انجام کونژوگاسیون، با استفاده از ژل فیلتراسیون و سفادکس 75-G و بافر رقیق کننده PBS با سرعت 41 میلی لیتر در ساعت برقرار گردید و تا زمان عبور مایع، معادل یک حجم بستر از ستون ادامه یافت. سپس با قرائت جذب فرکشن ها در طول موج 210 نانومتر، فرکشن های مربوطه جدا گردید(18،23 (
اندازه گیری سایز و شارژ مولکول PLGA و کونژوگه آن
جهت اطمینان بیشتر از صحت تشکیل کونژوگه از دستگاه FT-IR وZetasizer وAFM برای اندازه گیری و شارژ مولکول PLGA و LPS-PLGA استفاده گردید.
ایمنی سازی با آنتی ژن های تهیه شده
به منظور واکسیناسیون 12 عدد موش ماده سوری 6 تا 8 هفته با وزن 30-20 گرم، از موسسه دانش بنیان مدزیست خریداری شد. در هر گروه از 3 موش استفاده گردید و گروه های آزمون شامل:
گروه اول: شامل موش هایی که کونژوگه PLGA با لیپو پلی ساکارید را دریافت می کردند.
گروه دوم: شامل موش هایی که PLGA خالص را دریافت می کردند.
گروه سوم: شامل موش هایی که LPS را دریافت میکردند.
گروه چهارم: شامل موش هایی که نرمال سالین را دریافت می کردند.
دوره واکسیناسیون شامل 3 دوز تزریق 2/0 سی سیPLGA با غلظت 50میلی مولار و غلظت آنتی ژن های تزریقی 1 میکروگرم در هر دوز بود با فواصل دو هفته ای که خونگیری 2 هفته بعد از آخرین تزریق، از گردن موش انجام گردید و سپس آزمایش چلنج، انجام شد(29،49).
چلنج در موش
در این مرحله سه موش هرگروه با کتامینmg/kg50 و زایلازین mg/kg10 با 10 سی سی سرم فیزیولوژی مخلوط نموده و 6/0 سی سی داخل صفاقی به موش تزریق شد. بعداز اطمینان از بیهوشی موش زیر لوب آزمایشگاهی شکم موش را در شرایط استریل باز گردید. باکتری با غلظت 2 مک فارلند به مقدار 100 میکرولیتر با سرنگ انسولین به مثانه موش سوری تزریق و برای جلوگیری از آلودگی محل جراحی را با بتادین ضدعفونی نموده و با دقت محل بخیه زده شد. موش ها به مرحله ریکاوری انتقال یافتند و بعد از به هوش آمدن به قفسی که قبلاً ضدعفونی شده بود انتقال گردید. علائم بالینی در موش ها و بررسی وضعیت جسمانی آن ها در تمام روزهای 1 الی 7 صورت گرفت. در روز آخر موشها با اتر بیهوشی عمیق و مرگ کامل یافته وکالبدشکافی شده و مثانه آن ها خارج گردید. مثانه را بعداز خرد کردن در 10 سی سی بافر2/7 PBS: حل نموده و و با ورتکس هم زده شد(رقت 1/0) سپس از هرلوله دو رقت 01/0 و001/0 تهیه نموده وبا آنس استاندارد(01/0) از تمام رقت ها در پلیت محیط تریپتیک سوی براث به صورت خطی کشت داده شد، و بعد از گرما گذاری در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت تعداد کلنی ها شمارش گردید.
نتایج
بعد از مشاهده سوآرمینگ کلنی ها برروی محیط کشت بلاد اگار و انجام رنگ امیزی گرم از سویه های کشت داده شده باسیل های گرم منفی میله ای شکل مشاهده شد. نمودارهای (1) و (2) مربوط به شارژ نانوذره خالص PLGA و کونژوگه لیپوپلی ساکارید با PLGA می باشد. که عدد 98/2- مربوط به PLGA و عدد 482/0 مربوط به کونژوگه لیپوپلی ساکارید با PLGA می باشد و نتایج نمودارها حاکی از مثبت شدن شارژ کونژوگه نسبت به شارژ منفی PLGA است که موفقیت آمیز بودن کونژوگاسیون را تایید می نماید. در نمودار(3) شکل(الف) نمودار نانوذره PLGA و شکل(ب) نمودار LPS-PLGA می باشد. با توجه به شکل پیک های مربوط به اعداد موجی 1080.90، 1237.29 ،1385.33 و 1467.44 نشان دهنده گروه های اتری می باشد. که تقویت آن ها نیز نشان دهنده حضور پیوند های استری است(در کونژوگه و LPS ). ﺗﻐﯿﯿﺮ ﺳﺎﯾﺰ ﺳﺎﯾﺖ ﻫﺎی اﺗﺼﺎﻟﯽ ﻧﺎﻧﻮذرهPLGA از ارﺗﻔﺎع 8 ﻧﺎﻧﻮﻣﺘﺮ ﻗﺒﻞ از ﮐﻮﻧﮋوﮔﺎﺳﯿﻮن ﺑﻪ ارﺗﻔﺎع 81.35 ﻧﺎﻧﻮﻣﺘﺮ در PLGA-LPS و ﺗﻐﯿﯿﺮ ﺷﮑﻞ ﺳﺎﯾﺖ ﻫﺎی اﺗﺼﺎﻟﯽ ﻗﺒﻞ و ﺑﻌﺪ از اﻧﺠﺎم ﮐﻮﻧﮋوﮔﺎﺳﯿﻮن ﺟﺬب ﺳﻄﺤﯽ آﻧﺘﯽ ژن را در ﺳﺎﯾﺖ ﻫﺎی اﺗﺼﺎﻟﯽ ﻧﺎﻧﻮذره ﺗﺎﯾﯿﺪ ﻣﯽ ﻧﻤﺎﯾﺪ و ﮔﻮﯾﺎی اﯾﻦ ﻣﻄﻠﺐ اﺳﺖ ﮐﻪ ﮐﻮﻧﮋوﮔﺎﺳﯿﻮن ﺑﺎ ﻣﻮﻓﻘﯿﺖ اﻧﺠﺎم ﺷﺪه اﺳﺖ.
نمودار1- نتیجه شارژواکسن 98/2 -: PLG A خالص
نمودار 2- نتیجه شارژ نانوواکسن 482/0PLGA-LPS :
PLGA (الف)
PLGA-LPS(ب)
نمودار3-نمودارهای تایید کننده کونژوگاسیون بین LPS و PLGA با طیف سنجی مادون قرمز
(FT-IR) برای شناسایی ترکیبات آلی: شکل (الف) PLGA ، شکل (ب) کونژوگه لیپوپلی ساکارید با PLGA
(الف) PLGA
(ب) LPS-PLGA
(الف) PLGA ، شکل (ب) کونژوگه لیپوپلی ساکارید و PLGA
با توجه به شکل 1(الف و ب) مشاهده شد که سایتهای نانوذره PLGA از حالت تیزی به حالت کروی و پفکی تغییر شکل پیدا کرده که گواه این مطلب است که کونژوگاسیون با موفقیت انجام گرفته است. در تست چلنج مثانه بیشترین میانگین رشد مربوط به گروه کنترل بود. در تست آماری آنالیز واریانس یک طرفه که با نرم افزار SPSS انجام گرفت. تفاوت معنا داری بین تمام گروه های آزمون مشاهده گردید(05/0>p). با استفاده از آزمون تعقیبی Tukey ,LSD مشخص شد بین تمام گروه های آزمون در مقاسیه با گروه کنترل و PLGA تفاوت معنا دار وجود دارد. میانگین تعداد کلنی های شمارش شده در گروه کنترل به طور معنا داری ازتمام گروه ها بیشتر بود. در گروه کنترل و PLGA چون از واکسن کونژوگه استفاده نشده بود تفاوت معناداری از نظر تعداد کلنی با سایر گروه ها بود.این موضوع بیانگر این موضوع بود که ترکیب کونژوگه لیپوپلی ساکارید و PLGA مقاوت و ایمنی زایی مناسبی نسبت به گروه های کنترل و PLGA داشته است.
|
Std.Deviation
|
Mean CFU/ml |
تعداد |
|
|
0/2 ± |
102×98 |
3 |
گروه دریافت کننده نرمال سالین |
|
52/ 1 ± |
102×3/91 |
3 |
گروه دریافت کننده PLGA |
|
55/0 ± |
103×6/3 |
3 |
گروه دریافت کننده LPS |
|
05/ 1 ± |
10×2/6 |
3 |
گروه دریافت کننده LPS-PLGA |
بحث و نتیجه گیری
پروتئوس میرابلیس، باکتری میله ای، گرم منفی، فرصت طلب و یکی از علل شایع عفونت های ادراری است. این باکتری عامل عفونت در زنان، کودکان، افراد پیر و بیماران دارای سوند به مدت طولانی و افرادی با مشکلات مادرزادی و غیر مادرزادی در مجاری ادرار میباشد. مکانیسم بیماری زایی این باکتری دقیقاً مشخص نیست، اما عوامل ویرولانسی چون فعالیت آنزیم اوره آز، اتصال به سلول های اورواپی تلیال، همولیزین، حرکت و قدرت تهاجم باکتری را در بیماری زایی آن موثر میدانند(7،36،37). این باکتری مقاومت بالایی نسبت به آنتی بیوتیک های معمول مورد استفاده دارد. مقاومت آنتی بیوتیکی باکتری، دلیل اصلی شکست در درمان است(5). از این رو در این پژوهش به ارزیابی ایمنی زایی نانو واکسنی متشکل از کونژوگه PLGA و LPS دتوکسیفای شده پروتئوس میرابلیس در مدل حیوانی مبتلا به عفونت ادراری پرداخته شده است، تا گامی در جهت پیشگیری از عفونت ادراری ناشی از این باکتری برداشته شود. در مطالعه ای در سال 2010 اثبات شد که آنتی ژن ها و فاکتورهای رشد انسانی به طور موفقیت آمیزی در نانوذره PLGA یا بستری از آن ترکیب میشوند. از سال 1999 اداره غذا و داروی آمریکا استفاده از PLGA را در داروهای مختلف و به خصوص در داروهای ضد سرطانی مورد تایید قرار داده است(12). در این تحقیق نیز از کونژوگه ی PLGA(به عنوان سیستم انتقال دهنده به منظور افزایش کارایی واکسن و انتقال موثر آن به سیستم ایمنی) و لیپوپلی ساکارید(به عنوان آگونیست) TLRs استفاده شد. پپتیدوگلیکان دیواره ی سلولی یا لیپو پلی ساکارید باکتری های گرم منفی پاسخ ایمنی را علیه آنتی ژن هایی که همراه با آن ها توزیع میشوند، افزایش می دهد. فعالیت آن ها از فعال سازی گیرنده های شبه تول(TLRs)از طریق شروع سیگنالهای خطر سیستم دفاعی میزبان، تاثیر می پذیرد. امروزه به کارگیری آگونیست‌های TLRs در فرمولاسیون واکسن‌ها بسیار مورد توجه قرار گرفته است. این مولکول‌ها با اتصال به گیرنده‌های خود در سطح سلول‌های سیستم ایمنی به ویژه سلول‌های عرضه کننده آنتی‌ژن، موجب فعال شدن این سلول‌ها و آغاز پاسخهای التهابی میشوند. واکسن هایی که از لیپو پلی ساکارید استفاده می کنند، می باید بیشتر تخلیص شده و اغلب سم زدایی شوند(8). در این پژوهش نیز LPS مطابق روش ذکر شده تخلیص و سپس دتوکسیفه، دیالیز و خالص سازی شد. واکسن های پلی ساکاریدی در فعال کردن سلول های Th ناتوان هستند و فقط سلول های B را به صورت مستقل از T فعال میکنند، یک راه جهت تحریک مستقیم سلول های Th در پاسخ به آنتی ژن های پلی ساکاریدی، کونژوگه کردن آنتی ژن با انواعی از حامل ها است. در چند دهه اخیر واکسن های کونژوگه متعددی به منظور القای حفاظت علیه ارگانیسم های بیماری زا طراحی شده است. از جمله پژوهش هایی که در طی آن ایمنی زایی کونژوگه در مقایسه با LPS بیشتر بوده است، می توان به پژوهش میدیونتر و همکاران اشاره کرد که در آزمایشات خود شاهد ایمنی زایی بیشتر کونژوگه لیپو پلی ساکارید- توکسوئید دیفتری در مقایسه با LPS در موش ها بودند. در آزمایشات کریز و همکاران(1986) نیز میزان ایمنی زایی کونژوگه LPS با توکسوئید دیفتری بیش از LPS بود(19). یکی از متداول‌ترین پلیمرهای مورد استفاده برای تولید نانوذرات پلیمری، نانو ذره PLGA، پلی‌لاکتیک کوگلیکولیک اسید، است. پلی‌لاکتیک کوگلیکولیک اسید(PLGA) یکی از توسعه یافته‌ترین پلیمرهای زیست‌سازگار و زیست تخریب‌پذیر از خانواده پلی‌استرهای آلیفاتیک است و به خاطر خواص جذابش به یک انتخاب محبوب در برنامه‌های کاربردی دارورسانی تبدیل شده است. با توجه به خواص و زیست‌سازگاری مناسب PLGA از این پلیمر برای کپسوله کردن انواع داروها و مواد زیستی استفاده میشود(1). در پژوهش حاضر نیز آنتی ژن لیپو پلی ساکارید را با نانوذره پلیمری PLGA همراه نموده و کاندید نانو واکسن کونژوگه ی قوی و ایمونوژنی علیه عفونت ادراری ناشی از پروتئوس میرابلیس تولید شود. ابتدا تست های تشخیصی از طریق مشاهدات میکروسکوپی و ماکروسکوپی و تست های بیوشیمیایی که تاییدی بر وجود پروتئوس میرابلیس بودند، انجام شدند. سپس به منظور اطمینان از صحت تشکیل کونژوگه از دستگاه Zetasizer استفاده شد. این دستگاه، دستگاه اندازه گیری ذرات نانو است، که توانایی اندازه گیری سه مشخصه ذرات یا مولکول ها در محیط مایع را دارد. این سه پارامتر بنیادی عبارتند از :اندازه ذره(Particle size)، پتانسیل زتا(Zeta potential) وزن مولکولی(Molecular weight)با به کار بردن تکنولوژی منحصر به فرد در دستگاه Zetasizer می توان این پارامترها را در دامنه وسیعی از غلظت ها اندازه گیری کرد. یکی از خصوصیات بارز این دستگاه ، اندازه گیریهای تکرارپذیر و دقیق با کنترل دقیق دما است. نتایج نمودارهای(1) و(2) حاکی از مثبت شدن شارژ کونژوگه نسبت به شارژ منفی PLGA بود که موفقیتآمیز بودن کونژوگاسیون را نشان می دهد. تست دیگری که در این پژوهش انجام گرفت، تست FT-IR(طیف سنجی تبدیل فوریه مادون قرمز) است. طیف سنجی مادون قرمز بر اساس جذب تابش و بررسی جهش‌های ارتعاشی مولکول‌ها و یون‌های چند اتمی صورت می‌گیرد مطابق با نمودار(3)، پیک عدد موج 1654.07 مربوط به گروه(O=C-OH ) لیپو پلی ساکارید، 3414.26 مربوط به گروه های OH قندی و 3291.4 مربوط به CH قندی هستند. جابجایی شیمیایی موجود نشان دهنده ی برقراری پیوند کوالان مابین دو مولکول PLGA و LPS و کونژوگاسیون موفق است. به منظور بررسی جذب سطحی آنتی ژن از میکروسکوپ نیروی اتمی (AFM) استفاده شد. این میکروسکوپ دستگاهی است که برای بررسی خواص و ساختار سطحی مواد در ابعاد نانومتر به کار می رود. نتایج حاصل از این بررسی نشان دهنده ی تغییر سایز سایت های اتصالی نانو ذره PLGA از ارتفاع 8 نانومتر قبل از کونژوگاسیون به ارتفاع 81.35 نانومتر در LPS-PLGA و تغییر شکل سایت های اتصالی از حالت تیزی در قبل از کونژوگاسیون به حالت کروی و پفکی در بعد از انجام کونژوگاسیون جذب سطحی آنتی ژن بود، که بیانگر موفقیت آمیز بودن کونژگاسیون می باشد. همان طور که ذکر شد گروه آزمون اول با کونژوگه PLGA-LPS، گروه آزمون دوم با PLGA خالص، گروه آزمون سوم با LPS تنها و گروه کنترل که نرمال سالین دریافت کردند، ایمنی زایی گروه آزمون با LPS در مقایسه با گروه آزمون با کونژگه ی LPS-PLGA کمتر بود و واکسن کونژوگه قوی تر و ایمونوژن تر عمل نموده است. این امر نشان دهنده ی همین مطلب است که واکسن های پلی ساکاریدی چون LPS به تنهایی قابلیت ایمنی زایی بالایی ندارند و باید به صورت کونژوگه با ترکیبی دیگر استفاده شوند. واثق(1395)، ایمنی زایی کونژوگه نانوذره پلی لاکتیک گلیکو اسید و توکسوئید تتانی، دیفتری و انتروتوکسین B استافیلوکوک را در مدل موشی مورد مطالعه قرار داد. نتایج مطالعات او نشان دهنده ی اثر ایمونو مدلاتوری PLGA بود و مشخص شد که این نانوپلیمر به خودی خود بر روی کم و کیف پاسخ ایمنی می‌تواند تاثیر گذار باشد(11). نتایج این تحقیق نشان داد که ایمنی زایی PLGA به طور معناداری(05/0>p) با گروه کنترل متفاوت بود. در تست چلنج پژوهش حاضر نیز گروه های کنترل بیشترین میزان رشد را داشتند و میانگین تعداد کلنی های رشد کرده آن به طور معنا داری ازتمام گروهها بیشتر بود. طبق آزمون آماری آنالیز واریانس یکطرفه که با نرم افزار SPSS انجام گرفت، بین تمام گروه ها تفاوت معناداری(05/0>p) وجود داشت و بر اساس آزمون Tukey, LSD نیز ایمنی زایی PLGA به طور معناداری با گروه کنترل متفاوت بود. لذا، نتایج بررسیهای پژوهش حاضر را می توان در تطابق با پژوهش های دیگر انجام شده دانست. نتایج ارزیابی ایمنی زایی کونژوگه ریبوزیل ریبیتول فسفات هموفیلوس آنفولانزای تیپ b با پروتئینKeyhole Limpet Hemocyanin و نانوذره PLGA توسط اردستانی و همکاران(1392) نشان داد که اضافه شدن PLGA به کونژوگه RPR-KLH باعث افزایش نفوذپذیری و جذب آن در سلول های ایمنی شده است(12). در تحقیقی که در سال 2012 انجام شد، PLGA به عنوان حامل مناسبی برای انتشار تسهیل یافته آنتی ژن ها با قابلیت لیگاند شدن اختصاصی با مولکولهای هدف و افزایش تیتر ایمونوگولوبولین ها و افزایش معنی دار پاسخ های ایمنی مطرح شد(15). با بررسی اثر ادجوانتی نانوذرات طلا بر ایمنی زایی نوروتوکسین بوتولینوم تیپ E نشان دادند که این نانوذرات هم می توانند همانند PLGA در این مطالعه، باعث تحریک سیستم ایمنی و در نتیجه بروز پاسخ شوند(22). چرا که در این پژوهش نیز بین گروه کنترل و PLGA که واکسن کونژوگه استفاده نشده بود، با سایر گروه ها تفاوت معناداری از نظر تعداد کلنی مشاهده شد. لذا، مطابق با سایر پژوهش های ذکر شده، این امر نشان دهنده ی ایمنی زایی و مقاومت مناسب این کونژوگه و مناسب بودن PLGA به عنوان حامل آنتی ژنی LPS است. زیرا، نانوذره PLGA دارای انتهاهای اتصالی بسیار است و خاصیت ترکیب پذیری بالایی با داروی مبدا و سلول هدف دارد. به طور کلی، این مشاهدات بر اساس اطلاعات به دست آمده در شرایط آزمایشی مختلف(مدل های درون تنی و برونتنی مختلف، پروتئین های مختلف، غلظت های متفاوت، پلیمرهای مختلف و غیره) بوده است و نمی توان نتایج مختلف را به طور کامل با هم مقایسه کرد و در مواردی با هم دچار اختلاف و تضاد هستند. مسننی و همکاران(1396) با بررسی ایمنی زایی ترکیب کونژوگه نانو ذره PLGAبه همراه آلژینات سودوموناس آیروژینوزا به عنوان کاندیدای نانو واکسن در مدل خرگوشی پرداخت و مشخص نمود که در تست چلنج خرگوش هایی که نانو واکسن دریافت کرده بودند باکتری های کمتری در طحال رشد کرده بودکه نشان دهنده بهبود سیستم ایمنی بدن می باشد(9). در تحقیق حاضر نیز در مثانه موش هایی که کونژوگه LPS-PLGA را دریافت کرده بودند باکتری کمتری درمقایسه با بقیه گروه ها رشد کرد بود. دراین پژوهش برای اولین بار از باکتری پروتئوس میرابیلیس جهت ایجاد عفونت ادراری که به طورمستقیم به مثانه تزریق شده استفاده گردید ودر نهایت نتایج بیان گر آن بود که کونژوگه LPS-PLGA توانایی بهتری در پیشگیری از عفونت ادراری در موش سوری نسبت به گروه های خالص مثل LPS، PLGA، نرمال سالین دارد و می تواند سیستم ایمنی بدن را تحریک کند. هم چنین مشخص شد نانوذره به کار رفته PLGA قابلیت مناسبی برای استفاده به عنوان حامل در ساخت واکسن دارد. بنابر این کونژوگه تهیه شده به عنوان کاندید نانو واکسن برای پیشگیری از عفونت ادراری در موش سوری موثر خواهد بود.
)