اثرات سلول‌های بنیادی مزانشیمی ژله وارتون به همراه صمغ درخت بنه در درمان آسیب‌های پوستی ناشی از سوختگی

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسنده

گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران

چکیده

زمینه‌وهدف: سوختگی یکی از آسیب‌های رایج در جهان است که می توان از روش‌های نوین مانند سلول‌درمانی و طب سنتی برای درمان آن استفاده کرد. هدف از مطالعه‌ی حاضر بررسی اثرات ضمادی از صمغ بنه و روغن حیوانی به‌همراه سلول‌های بنیادی مزانشیمی ژله وارتون در درمان سوختگی درجه سه در رت‌های نژاد ویستار می‌باشد.
روش‌کار: در این آزمایش تجربی، سلول‌های بنیادی از طریق جداسازی سلول‌های ژله وارتون از بندناف انسانی حاصل شد. برای انجام این مطالعه 28 رت بواسطه استامپ فلزی سوزانده و سپس به طور تصادفی در دو گروه کنترل(7 موش) و تیمار(21 موش) تقسیم شدند. گروه تیمار به سه دسته(هر گروه 7 موش) تیماربا ضماد، سلول‌درمانی و سلول‌درمانی بعلاوه ضماد تقسیم شدند. به هر رت تعداد 106 سلول در پاساژ سه و به‌صورت زیرجلدی تزریق شد. در روز 30 بعداز درمان آسان‌کشی با کلروفروم و تهیه‌ی مقاطع بافتی با رنگ‌آمیزی هماتوکسیلسن-ائوزین و تری‌کروم‌ماسون برای بررسی‌های میکروسکوپی صورت گرفت.
یافته‌ها: مشاهدات میکروسکوپی نشان داد‌که در گروه‌های تیمار روند بهبودی با سرعت بالاتری نسبت گروه کنترل انجام گرفت. هم‌چنین بعد از گذشت 30 روز روش سلول‌درمانی+ ضماد به‌طور معنی‌داری موثرتر نسبت به ضماد و تزریق سلول به‌تنهایی بود. مطالعات بافت شناسی نشان دهنده‌ی ازدیاد معنی‌دار در آنژیوژنز، سنتز کلاژن، تعداد سلول‌ها، ضخامت لایه‌های پوست و در نهایت تسریع ترمیم زخم در نمونه‌های تیمار در مقایسه با نمونه‌های گروه کنترل بود.
نتیجه‌گیری: براساس نتایج به‌دست آمده، روش‌های درمانی هم‌زمان استفاده شده در این مطالعه در تسریع ترمیم زخم‌های پوستی در مدل حیوانی به‌طور معنی‌داری تاثیر گذار بوده است.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

The Effects of Wharton's Jelly Mesenchymal Stem Cells Associated with Gum of Pistacia atlanticafor Burn Wound Healing

چکیده [English]

Background: Burn is a common wound in the world and consider the novel methods such as cell therapy can be a helpful strategy in the treatment. The purpose of the present study is investigating the effects of using ointment of animal oil mixed with Gum of Pistacia atlantica associated wharton's jelly mesenchymal stem cells (WJMSCs) on rat third-degree burn models.
Methods:In this experimental study, WJMSCs were extracted from human umbilical cord. For this study, 28 Wistar rats were burned by heating a metal rod of 1cm in diameter and then randomly divided into the control (7 rats) and treatment (21 rats) groups. The treatment group was divided into three groups (each group of 7 rats) of daily scrubbingof ointment, cell therapy, and cell therapy+ ointment. 106 cells (passage3) were injected into each rat subcutaneously. On day 30 after treatment, animals killed by chloroform and histological sections were prepared by staining Hematoxylsene-Eosin (H&E) and Trichromosone done for microscopic study.
Results: Macroscopic and microscopic results indicated that in the experimental groups, the recovery was significantly more than the control. Also, the cell therapy+ ointment was significantly more effective than ointment and cell alone after 30 days. Histological analysis demonstrated a significant increase in angiogenesis, collagen synthesis, number of cells, thickness of skin layers, and totally acceleration wound healing in experimental groups compared to controls.
Conclusion: Based on these data, it can be suggested that simultaneous cell-therapy and traditional medicine accelerate the repair of skin burns in the animal models more significantly.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Cell-therapy
  • Gum of Pistacia atlantica
  • Histology
  • Wharton's jelly mesenchymal stem cells

مقدمه

 

سوختگی یکی ازمخرب­ترین آسیب­ها و نگرانی­های عمده­ی سازمان جهانی بهداشت است(19، 29). سوختگی در رده­ی چهارم شایع­ترین آسیب­ها بعد از تصادفات رانندگی، سقوط­ها و خشونت­های بین فردی قرار گرفته است. هر ساله بیش از 300000 نفر در اثر سوختگی می­میرند. میلیون­ها نفر­ از معلولیت و ناتوانایی­های اجتماعی، روانی و اقتصادی ناشی از سوختگی رنج می برند. حدود 95 درصد از مرگ­های ناشی از سوختگی مربوط به آتش­سوزی در کشورهای کم درآمد و با در­آمد متوسط رخ می­دهد(25).سوختگی به­عنوان یکی از عمده دلایل آسیب بافتی پوست شناخته می­شود که علاوه بر افزایش آسیب­پذیری نسبت به ورود عوامل بیگانه،­موجب از دست رفتن آب بدن و شکل طبیعی پوست می­شود(30). سوختگی نوعی آسیب به گوشت یا پوست است که بر اثر گرما، برق، مواد شیمیایی، اصطکاک یا پرتو به‌وجود می­آید و ممکن است با اختلالات عاطفی و روانی همراه باشند. در سوختگی با ضخامت کامل یاسوختگی درجه سوم به همه­ی لایه­های پوست آسیب می­رسد ودرمان­های مورد نیاز به شدت سوختگی بستگی دارد(16).به­طور کلی فرآیندترمیم سوختگی شامل مجموعه­ای از فرآیندهای سلولی، مولکولی و بافتی می­باشد که در این بین رگ­زایی و تشکیل یک شبکه­ی عروقی وسیع،­نقش مهمی درگسترش یک محیط التهابی موضعی جهت پاکسازی این محیط از عوامل بیگانه و پاتوژن­ها را دارا می­باشد(33). در واقع ترمیم زخم یک فرآیند چهار مرحله­ای هم­پوشانی کننده شامل مراحل انعقاد، التهاب، فیبروپلازی و تغییر آرایش بافتی است. در فاز انعقاد، در نتیجه­ی انقباض عروق و آزاد شدن کاتکول­آمین­ها دیاپدز آغاز می­گردد. در فاز التهاب، زخم به­وسیله­ی سلول­های فاگوسیتوز­کننده اشغال می­شود. در فاز فیبروپلازی، فیبروبلاست­هایی که به زخم مهاجرت کرده­اند انواع کلاژن را سنتز و ترشح می­کنند و در نتیجه به استحکام زخم افزوده می­شود و آنژیوژنز در این مرحله رخ می­دهد. در مرحله­ی تغییر آرایش بافتی، بافت حالت طبیعی خود را به­دست می­آورد(1). با توجه به این مطالعات به­نظر می­رسد، استفاده از روش­های نوین هم­چون سلول درمانی به­عنوان یک رهیافت غیر تهاجمی، بتواند جایگزین مناسبی برای روش­های قدیمی درمان باشد. سلول­درمانییک استراتژی جالب و مؤثر در درمان بیماری­هاست و شامل جایگزین کردن سلول­های بنیادی یا بافت ساخته شده از سلول­های بنیادی برای بیماری و آسیب­های مختلف است و تاکنون طی تحقیقات متنوع، سلول­های بنیادی مختلف در درمان بیماری­ها به­کار رفته­اند (7). Guو همکاران (2014) دریافتند سلول­های بنیادی با منشا چربی می­تواند سرعت ترمیم زخم رت را به مقدار قابل توجه افزایش دهد (8). التیام زخم پوستی روندی است که با هماهنگی بافت­ها، سلول­ها و فاکتورهای مختلف صورت می­گیرد. مکانیسم­های احتمالی موثر در تسریع بهبود زخم شامل افزایش عوامل رشد، افزایش تعداد ماکروفاژها، قدرت کشش­پذیری زخم، ایجاد عروق، سنتز کلاژن و تعداد فیبروبلاست­ها است. عواملی که سبب کاهش التهاب و ضدعفونی زخم می­شوند می­توانند بر ترمیم سوختگی اثر مثبت داشته باشند. میزان رگ­زایی و توسعه­ی عروق خونی در واقع یکی از موثرترین عوامل ترمیم زخم است. هم‌چنین از عمیق شدن زخم سوختگی ممانعت می­کند. اگر عاملی مانند دارو بتواند از طریق مکانیسم­های بیوشیمیایی و فارماکولوژیک تشکیل عروق خونی را تشدید کند و قادر به تغییر گردش خون بافتی در ناحیه­ی سوختگی شود باعث ترمیم می گردد(8).استفاده از سلول­های بنیادی در برنامه­های بازسازی بافتی به­دلیل سهولت امکان تکثیر و جداسازی در شرایط آزمایشگاهی و توانایی بالقوه­ی آن‌ها در پیشبرد و تسریع روند بهبود آسیب­های بافتی از طریق تولید فاکتورهای رشد متعدد بسیار مورد توجه قرار گرفته است(20). در این مطالعه، جداسازی و کشت سلول­های بنیادی مزانشیمی از ژله وارتون بندناف انجام گرفت. تلاش­های متعددی برای جداسازی و کشت سلول­های بنیادی از پوست انسان و موش صورت گرفته است که منجر به درک بهتری از عوامل مولکولی، مسیرهای سیگنالینگ و وقایع سلولی شده است(3). امروزه سلول های بنیادی ژله وارتون بندناف به عنوان یک منبع مناسب سلولی مورد توجه قرار گرفته اند. علت استفاده از این سلول‌ها دسترسی آسان، کم هزینه بودن، عدم وجود روش‌های تهاجمی در جدا کردن بافت از شخص دهنده، توانایی تمایز به سلول‌های مختلف و منابع فراوان این سلول‌ها می‌باشد(14). بندناف شامل دو شریان و یک ورید بندناف است و هر دو در بافت همبند موکوسی خاصی، به نام ژله‌وارتون، که به وسیله‌ی اپیتلیوم آمنیونی پوشیده شده است، قرار دارند. بندناف زباله‌های بیمارستانی در نظر گرفته شده و دست­یابی به این سلول­ها روشی غیر تهاجمی‌ محسوب می شود، علاوه بر این دسترسی به سلول‌های بنیادی مزانشیمی بندناف دست و پا گیر نیست و فاقد مشکل اخلاقی است. سلول‌های بنیادی مزانشیمی بندناف شبیه سلول‌های بنیادی استخراج شده از منابع دیگر ظرفیت مجزایی برای خودتجدیدی دارند، در حالی که چندتوانی خود را حفظ می‌کنند و توانایی تمایزی بالایی دارند هرچندکه برخی از این توانایی‌های تمایزی به صورت جزئی شناخته شده‌اند(22، 27). مطالعات نشان داده که سلول‌های بنیادی ماتریکس بندناف (UCMS) قادرند در محیط کشت به سلول‌های عصبی، عضلانی، قلبی، غضروفی و استخوانی تمایز یابند همچنین تزریق این سلول‌ها به مغز موش صحرایی باعث بهبود علائم پارکینسون موش‌ها و تمایز این سلول‌ها به سلول‌های عصبی شده است، بر این اساس، می‌توان این سلول‌ها را در زمره سلول‌های پرتوان به شمار آورد(24،28). علاوه بر این سلول‌های بنیادی مزانشیمی بندناف به دلیل خواص تعدیلی ایمنی آن‌ها مورد توجه زیادی قرار گرفته‌اند. به طوری که امروزه سلول‌های بنیادی مزانشیمی به عنوان یک منبع مناسب، برای احیای پزشکی و ایمنی‌درمانی پیشنهاد شده‌اند (10). در سال 2019 Nazempour  و همکاران از سلول های بنیادی ژله­ی وارتون بندناف انسان برای درمان مدل سوختگی در رت استفاده کردند. آنها در این مطالعه از داربست آسلولارشده آمنیون انسانی به همراه سلول­های ژله وارتون در درمان مدل سوختگی استفاده کردند و نتایج آنها نشان داد که سلول­درمانی و اثرات ضد التهابی این سلول­ها تاثیر چشم­گیری در بهبود زخم­های سوختگی داشته است و می تواند به عنوان روشی نوین در درمان سوختگی مورد توجه قرار گیرد (23). همچنین  در سال 2019 Hashemi و همکاران برای درمان زخم های مزمن همچون زخم­های دیابتی از داربست­های بیولوژیک به همراه سلول­های ژله­ی بندناف انسانی استفاده کردند و در نتایج خود بیان داشتند که بعد از حدود 9 روز استفاده ازاین سلول­ها سبب کاهش معنی­داری در اندازه­ی زخم­های مزمن گردید و بنابراین سبب تسریع در بهبود این­ زخم­ها گردیدند ( 9). بعلاوه ترکیب طب سنتی ایرانی با درمان های نوین می تواند ایده ای بسیار موثر برای درما انواع بیماری باشد. قابل ذکر است که گزارشات سازمان بهداشت جهانی تایید کرده که هنوز بیش از 80 درصد از مردم دنیا از طب سنتی و گیاها دارویی برای درمان انواع بیماری ها استفاده می کنند. امروزه در برخی از مناطق ایران از ترکیب روغن حیوانی و صمغ بنه برای درمان سوختگی استفاده می شود.  Pistacia atlanticaیکی از گونه­های پسته وحشی در ایران است که در مناطق زیادی از کشور و بویژه نواحی زاگرسی بصورت خودرو می روید (5). در طب سنتی ایران از این گیاه و صمغ آن در موارد زیادی از جمله در درمان مشکلات معده، عفونت­ها، اگزما، آسم استفاده و به­عنوان ضد التهاب، ضدویروس و ضد باکتری کاربرد دارد.  صمغ بنه شامل ترکیباتی همچون ترکیبات اسید چرب، ترانس وربنول و پینن می باشد که مطالعاتی در ارتباط با فعالیت های بیولوژیک و بویژه ضد میکروبی آنها انجام گرفته است(2، 15). همچنین روغن حیوانی گوسفند نیز سرشار از اسیدهای چرب غیر اشباع است که بطور سنتی در برخی مناطق ایران برای ترمیم سوختگی استفاده می گردد(11).با توجه به آنچه گفته شد هدف از مطالعه ی حاضر بررسی اثرات سلول درمانی و ضماد صمغ درخت بنه ترکیب شده با روغن حیوانی گوسفند و بررسی اثر هم­زمان این ضماد به­همراه سلول­درمانی در درمان سوختگی درجه سه در رت های نژاد ویستار می باشد.

مواد و روش ها

این مطالعه بصورت تجربی بوده و در سال های  1397تا 1398 و بارعایت کامل ضوابط اخلاقی کار بر روی حیوانات آزمایشگاهی، در آزمایشگاه تحقیقاتی کشت سلول دانشکده علوم، دانشگاه شهید چمران اهواز انجام شد.

جداسازی و کشت سلول های بنیادی مزانشیمی از ژله وارتون بندناف

در ابتدا بند ناف پس از به دست آمدن و خارج شدن خون بلافاصله در سرم فیزیولوژیک حاوی آنتی‌بیوتیک (پنی سیلین/ استرپتومایسین 5% )به آزمایشگاه کشت سلول منتقل و سپس توسط بافر فسفات سالین ((PBS حاوی آمفوتریسین 1% و حاوی آنتی‌بیوتیک 3% شستشو داده شد. مطابق روش ها ذکر شده در مقالات قبلی جداسازی سلول صورت گرفت(14).بطورخلاصه بافت بندناف تکه تکه شد و رگ­های خونی و پرده­های جنین کنار زده شد و ژله وارتون جداسازیو استحلال به­روش قطعات بافتی (Explant)‌ انجام شد. پس از جداسازی، سلول ها به فلاسک منتقل و در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی گراد، 5 درصد CO2 و 95 درصد رطوبت به مدت چند هفته تا پاساژ سوم کشت داده شدند. محیط کشت هر 3 روز یکبار تعویض و سلول ها بطور روزانه در زیر میکروسکوپ مورد مطالعه قرار گرفتند. سپس سلول ها در فلاسک T25(SPL, Korea) و در محیط کشت DMEM (Gibco, USA) همراه با 10% سرم جنینی گاو FBS (Gibco, USA) و 1% انتی بیوتیک استرپسین (Gibco, USA) تا پاساژ سوم نگهداری شدند و بدنبال آن و بعد از پر کردن کف فلاسک با تراکم بالای 80% با استفاده از ترپسین/ EDTA(Gibco, USA, .25%)  پاساژ و با استفاده از لام نئوبار شمارش و به تعداد مساوی 106 × 1 در هر میکروتیوپ محتوی 5/0 میلی­لیتر ریخته و به صورت زیرجلدی با استفاده از سرنگ انسولین در لبه های زخم سوختگی تازه ایجاد شده تزریق شدند (10).

مطالعات حیوانی و ایجاد مدل سوختگی

در این مطالعه که بر روی رت­هاینر نژاد ویستار انجام گرفت، تعداد 28 سر رت با وزن 200-250گرم از خانه­ی حیوانات دانشکده­ی دامپزشکی دانشگاه شهید چمران اهواز تهیه شد و پس از خریداری حیوانات به خانه­ی حیواناتدانشکده­ی علوم منتقل شدند و به­مدت یک هفته در شرایط استاندارد برای سازگاری با محیط جدید نگهداری شدند(امکان دسترسی به آب و غذا نامحدود بود و 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی). مدل سوختگی درجه­ی سه با استفاده از یکاستامپ فلزی به قطر 1 سانتی­متر که به­مدت چند دقیقه در آب جوش با دمای 100 درجه­ی سانتی­گراد قرار داده ­شد، ایجاد شد. ابتدا حیوانات با استفاده از تزریق درون صفاقی مخلوطی از کتامین(80 میلی­گرم­/کیلوگرم) و زایلازین(10میلی­گرم­/کیلوگرم) بی­هوش شدند و پس از مشاهده­ی علائم بی­هوشی موهای ناحیه­ی پشت حیوانات تراشیده ­شد و با بتادین ضدعفونی شدند.استامپ داغ به­مدت 30 ثانیه بر روی بدن موجود قرار داده شد. بعد از القای مدل سوختگی، رت­هادر 2 گروه کنترل و تیماربه­طورتصادفی تقسیم شدند. رت­های گروه کنترل بدون استفاده از درمان خاص و رت­های گروه تیمار به سه دسته تقسیم شدند دسته­ی اول مالیدن روزانه ضماد (ترکیب 2به­1 از صمغ و روغن)، دسته­ی دوم تزریق زیر جلدی سلول­های بنیادی در اطراف ناحیه­ی سوختگی و دسته­ی سوم با تزریق هم­زمان سلول و مالش روزانه ضماد تحت درمان قرار گرفتند. حیوانات به­صورت جداگانه در قفس­های استاندارد با شرایط روز و شب طبیعی و امکان دسترسی نامحدود به آب و غذا تا انتهای دوره­ی درمان نگهداری شدند (21، 35).

مطالعات هیستومورفومتری

برای انجام مطالعات میکروسکوپی، حیوانات در روز30 تحت آسان­کشی با کلروفرم قرار گرفته و پوست ناحیه­ی تحت درمان با اسکالپل در ابعاد 2˟2 جدا شد. پس از تهیه­ی مقاطع بافتی و انجام رنگ­آمیزی­های عمومی هماتوکسیلن-ائوزین و اختصاصی تری­کروم­ماسون عکس­برداری با میکروسکوپ نوری برای بررسی­های بافتی با استفاده از نرم­افزار ImageJ انجام شد. نتایج با استفاده از نرم­افزارSPSS(Ver.16) و آزمون­های آماریANOVA و Tukey به صورت(Mean±SEM) مورد ارزیابی قرارگرفت. رسم جدول­ها در نرم­افزار Word 2016 و رسم نمودارها در نرم­افزارExcel 2016 انجام گرفت و تفاوت­هایی با 05/0> pمعنی­دار در نظر گرفته شد.

نتایج

بررسی مورفولوژی سلول­های سلول های بنیادی مزانشیمی ژله وارتون

بررسی مورفولوژی سلول­های سلول های بنیادی مزانشیمی ژله وارتون کشت داده شده با استفاده از میکروسکوپ اینورت انجام گرفت، شکل 1 نشان دهنده­ی چونگی خروج و رشد این سلول ها و حالت دوکی شکل و کشیده سلول­ها، ارتباطات سلولی و سالم بودن سلول­ها می­باشد (شکل 1).

 نتایج هیستومورفومتری

همچنین بررسی­های میکروسکوپی در نمونه­های با رنگ­آمیزی H&E در روز 30 نشان داد که ضخامت درم و اپی درم در گروه های تیماری نسبت به گروه کنترل به طور معنی داری بیشتر بود. در نتایج به­دست آمده از مطالعات بافت­شناسی در این پژوهش تغییرات رنگ در نمونه­های با رنگ­آمیزی تری­کروم­ماسون نشان داد که سنتز کلاژن در نمونه­های گروه­های تیمار نسبت به نمونه­های گروه کنترل سریع­تر شروع شده و میزان کلاژن نیز بیش‌تر بوده است. شدت رنگ آبی کلاژن که نشان دهنده­ی میزان تشکیل کلاژن است نشان داد روند تشکیل کلاژن در گروه­های تیماری به طور محرزی سریع­تر از گروه کنترل بود. میانگین تعداد عروق خونی و سلول­های فیبروبلاست در روز 40 پس از تیمار در گروه­های تیمار و کنترل تفاوت معنی­داری(05/0>p ) نشان دادند.نتایج موفولوژیکی و هیستولوژیکی در این پژوهش نشان داد که در بین نمونه ای تیمار بعد از30 روز در نمونه های گروهی که فقط سلول دریافت کرده بودند بهبودی و بسته شدن محل زخم سریعتر از نمونه ای که فقط ضماد دریافت کرده بودند اتفاق افتاده است (شکل­های 2 و 3  ). در مقایسه تعداد رگ های خونی و ضخامت اپیدرم در این دو گروه تفاوت معنی داری مشاهده نشد اما مقایسه تعداد سلول های فیبروبلاستی، تشکیل کلاژن و ضخامت درم در گروه دریافت کننده سلول بطور معنی داری بیشتر از گروه دریافت کننده ضماد بود. همچنین مطالعات نشان داد که گروه تیمار هم­زمان(ضماد+ سلول) بسیار سریعتر از دو گروه دیگر ترمیم شده و داده­های کمی حاصل از مطالعات بافت شناسی نشان­دهنده افزایش معنی دار تعداد سلول های فیبروبلاستی، رگ زایی و تشکیل کلاژن و افزایش ضخامت درم در گروه تیمار هم­زمان نسبت به دو گروه دیگر بود (جداول 1 و 2).

 

 

 

*

*

شکل 1- تصاویر حاصل از بررسی مورفولوژی سلول­های بنیادی مزانشیمی ژله وارتون بندناف انسان A: قطعات بافتی کشت شده به روش Explant  B: سلول های ژله وارتون در حال خروج، گسترش و تکثیر C: مورفولوژی سلول های ژله وارتون در پاساژ سوم.  تصاویر با استفاده از میکروسکوپ اینورت و بزرگ­نمایی 20× ثبت گردیده است. ستاره قرمز به خروج سلول­های مزانشیمی از قطعات بافتی اشاره دارد.

 

 

شکل 2- بررسی مورفولوژیکی درم و اپی­درم پوست در روز 30  با استفاده از رنگ آمیزی H&E با استفاده از میکروسکوپ نوری.  A*  و A. نمونه کنترل، B*و B. نمونه درمان با ضماد، C*و C. نمونه سلول­درمانی، D*و D. سلول­درمانی + ضماد (تصاویر ردیف A با بزرگ­نمایی4˟ و تصاویر ردیف B با بزرگ­نمایی 40˟  گرفته شده است). در این شکل ستاره­های آبی نشان دهنده اپیدرم و ستاره­های نارنجی نشان­دهنده درم هستند. همچنین فلش­های نارنجی نشان دهنده سلول­های فیبروبلاست و فلش­های مشکی نشان­دهنده عروق خونی می باشند.

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 3- بررسی مورفولوژیکی میزان تشکیل وتراکم کلاژن در روز 30 : تراکم کلاژن در گروه کنترل نسبت به گروه­های تیمار به­صورت معنی­داری کمتر بود. درگروه سلول­درمانی+ ضماد به نسبت دو گروه درمانی تراکم کلاژن به­صورت معنی­دار بیش‌تر بود. تراکم کلاژن در گروه سلول­درمانی در مقایسه با گروه ضماد بیش‌تر بود. A. نمونه کنترل، B. نمونه ضماد، C. نمونه سلول­درمانی، D. نمونه سلول­درمانی+ ضماد (تصاویر با بزرگ­نمایی4˟ گرفته شده است).  در این شکل ستاره­های آبی نشان دهنده اپیدرم و ستاره­های نارنجی نشان­دهنده درم هستند.

 

جدول 1- مقایسه­ی میانگین ضخامت اپی­درم و درم  بر حسب میکرومتر در روز 30 پس از درمان

الف. نمونه کنترل، ب. نمونه ضماد، ج. نمونه سلول­درمانی، د. نمونه سلول­درمانی+ ضماد.

ضخامت درم بر حسب میکرومتر

ضخامت اپیدرم بر حسب میکرومتر

گروه

13/11 ± 448 a

96/3 ± 16  a

گروه الف

14/14 ± 580 b

1/5 ± 38 b

گروه ب

8/9 ± 647 c

4/4 ± 39 b

گروه ج

4/15 ± 810 d

6/9 ± 64 c

گروه د

 

 

 

 

 

 

 

 

 

تیمارها با حروف لاتین متفاوت، اختلاف آماری معنی داری دارند(05/0≥p)

 

 

 

جدول 2- مقایسه­ی میانگین تعداد سلول­های فیبروبلاست و عروق خونی در روز 30 پس از درمان:

.الف. نمونه کنترل، ب. نمونه ضماد، ج. نمونه سلول­درمانی، د. نمونه سلول­درمانی+ ضماد.

تعداد عروق خونی

تعداد سلول های فیبروبلاست

گروه

1± 10 a

3 ± 45  a

گروه الف

2 ± 13 b

7 ± 57  b

گروه ب

2 ± 13 b

 ± 623 c

گروه ج

 ± 171 c

 ± 744 d

گروه د

حروف غیرمشترک بیان­گر وجود تفاوت معنی­دار در سطح اطمینان 05/0> p می­باشد

 

بحث و نتیجه گیری

نتایج حاصل از پژوهش حاضر نشان داد که تزریق زیرجلدی سلول­های بنیادی مزانشیمی ژله وارتون در ناحیه­ی سوختگی، باعث تسریع روند ترمیم زخم شده و مدت زمان لازم برای بهبود کامل زخم را کاهش داد. مکانیسم دقیق تاثیر سلول­های بنیادی در بهبود زخم کاملا مشخص نیست، ، هر چند که با توجه به مطالعاتی که تا به­حال انجام شده تاثیر داروهای مختلف و سلول­درمانی به همراه هم عامل تسریع در ترمیم زخم بوده است(15). هم­راستا با روش­های درمانی ما مطالعاتی انجام شده است از جمله Zuliani و همکاران(2013) با کشت سلول­های فیبروبلاستی و پیوند این سلول­ها به مدل حیوانی موفق به افزایش معنی­داری در روند بهبودی زخم­های پوستی شدند(36). هم­چنین Pezeshki و همکارانش(2014) موفق به درمان زخم­های پوستی با استفاده از پیوند سلول­های بنیادی مزانشیمی کشت­داده شده بر داربست کیتوزان/ ژلاتین شدند که سلول­های کشت داده شده در آزمایشگاه را با قرار دادن بر داربستی که از کیتوسان و ژلاتین بود به محل زخم پیوند داده شد و در نهایت مشاهده شد که گروه تیمار نسبت به گروه کنترل افزایش معنی­داری در روند بهبودی نشان داد (26). به­طورکلی نتایج حاصل از این مطالعه بیان­گر این مسئله می­باشد که در مدت زمان کوتاهی می­توان از طریق کشت سلول در محیط آزمایشگاه، سلول­های حاصل را در محل زخم تزریق کرده و سبب ترمیم زخم گردید.در این مطالعه استفاده هم­زمان از ضماد صمغ بنه و روغن حیوانی در کنار سلول­درمانی اثر چشم­گیری در بهبود روند ترمیم داشت. به نظر مهمترین اثر صمغ بنه در بهبود روند زخم می تواد بدلیل خاصیت ضد میکروبی و ضد التهابی ان باشد. همچنین، گرچه مکانیسم اثر مصرف موضعی روغن حیوانی بر ترمیم زخم به­طور دقیق مشخص نیست، اما به نظر می رسد مصرف روغن های حیوانی که به مقدار فراوانی حاوی اسیدهای چرب غیر اشباع هستند بخاطر اثرات ضد میکروبی، التهاب محل زخم را کاهش داده و به تسریع ترمیم آسیب­های پوستی و سوختگی کمک می کنند. بعلاوه پژوهش­های علمی گزارش داده اند که مصرف موضعی اسیدهای چرب با زنجیره کوتاه با تامین اسیدهای چرب ضروری می توانند سبب افزایش تکثیر سلولی د ر پوست شده و تشکیل اسکار هیپرتروفی را مهار کنند(13، 34). مطالعه ما نیز تایید کرد ضماد محتوی صمغ بنه و روغن حیوانی سبب افزایش معنی دار رگ­های خونی، سلول های فیبروبلاستی و ضخامت کلاژن در محل آسیب نسبت به نمونه کنترل گردیده است. در سال 1396 باقری و همکاران از روغن حیوانی برای درمان مدل سوختگی درجه دو در مدل سوختگی در رت­ویستار استفاده کردند و مطالعات پاتولوژی و مورفولوژیکی در روزهای مختلف طی روند ترمیم انجام دادند. اما برخلاف انتظار نتایج آنها نشان داد که روغن حیوانی نمی تواند سبب بهبود روند ترمیم سوختکی گردد و اعلام داشتند این روش معیارهای پایش پاتولوژیک را ارتقا نداده بود(4). که البته این تفاوت­ها می تواند بخاطر تفاوت نوع و کیفیت روغن استفاده شده، تفاوت در نوع ایجاد مدل سوختگی و غیره باشد. همچنین مطالعه مسموعی و همکاران نشان داد که استفاده هم زمان صمغ بنه با روغن حیوانی در مقایسه با کنترل سبب بهبود زخم سوختگی نوع دو در مدل رت گردید اما مقایسه انها با پوماد سولفادیازین نقره نشان داد که تاثیر پوماد بطور چشم گیری بیشتر از استفاده هم زمان صمغ بنه با روغن حیوانی بوده است (21). در مطالعه ای دیگر ظهور و همکاران اعلام داشتند که روغن حیوانی می تواند تاثیر مثبتی در روند ترمیم زخم سوختگی در خرگوش داشته باشد(35). مقایسه ی میانگین ضخامت درم و اپی درم برحسب میکرومتر در روز 30 نشان داد که ضخامت ضخامت درم و اپی درم در گروه های تیماری نسبت به گروه کنترل به طور معنی داری بیشتر بود. مطالعات Marchin و همکاران(2012) نشان داد که ترمیم اپی­درم سریع و درم کند است و حدود 4-3 هفته زمان لازم است تا درم ترمیم کلی یابد (18). مطالعات نشان داده است که آرایش یکنواخت و موج­دار رشته­های کلاژن، یکی از ویژگی­های حالت طبیعی پوست می­باشد و مشاهده­ی این آرایش در رشته­های کلاژنی بافت ترمیم یافته نشان دهنده­ی روند مناسب ترمیم می­باشد و این حالت در استحکام بافت بهبود یافته­ی زخم نقش زیادی دارند(18). همان­طور که در نتایج نشان داده شد رشته­های کلاژن در برش­های بافتی مربوط به گروه­های تیمار به­صورت شبکه­مانند و موج­دار می­باشند. با این­که در گروه کنترل نیز حضور کلاژن مشاهده شد، اما این انباشت کلاژنی به شکل موضعی و غیرهمگن بود و آرایش موج­دار و شبکه­ای رشته­های کلاژن دیده نشد. همچنین سلول­های فیبروبلاست موثرترین سلول­ها در پدیده­ی ترمیم زخم هستند. این سلول­ها با افزایش تعداد در محل آسیب دیده و ساخت ماتریکس و فیبرهای کلاژن در روند تشکیل بافت سالم دخالت می­نمایند(32). Tettamanti و همکاران (2004) از شمارش فیبروبلاست­ها در تعیین کیفیت ترمیم زخم و شکل­گیری بافت همبند در ترمیم زخم ناشی از زالو استفاده نمودند (32). هم‌چنین Eyarefe و همکاران(2010)، شمارش فیبروبلاست­های محل بخیه را به­عنوان شاخصی برای ترمیم زخم جراحی معرفی کردند(38). همگام با مطالعات فوق در پژوهش حاضر، از شمارش فیبروبلاست­ها به­عنوان یک شاخص در ارزیابی بافت التیامی استفاده شد. بعلاوه، در صورتی که عاملی بتواند در زمان مناسب تشکیل عروق خونی جدید را تحریک و تشدید نماید و خون­رسانی به منطقه را سبب شود می­توان گفت که روند ترمیم با موفقیت پیش می­رود و از عمیق شدن زخم جلوگیری می­شود. رگ­زایی برای تغذیه­ی زخم و تامین اکسیژن ضروری است. تاثیر سلول­های مزانشیمال به­ویژه از طریق تولید فاکتورهای آنژیوژنز دلیلی بر تحریک ایجاد بیش‌ترین میزان عروق در روز 30 در گروه­های تیمار شده با سلول می­باشد.  بطور کلی نتایج این تحقیق نشان داد که استفاده هم­زمان روش­های نوین درمانی یعنی سلول­درمانی به­همراه روش ­های سنتی می توانند در بهبود روند ترمیم سوختگی مناسب و موثر باشد. البته برای تهیه ضماد صمغ و روغن باید این دو ماده کاملا باهم ترکیب و یکدست گردند و توصیه می شود در صورت امکان روغن استریل گردد و همچنین می توان از سایر ترکیبات چربی مانند انواع موم ها برای ترکیب با صمغ و ایجاد حالت پومادگونه استفاده کرد.

تشکر و قدر دانی

این مطالعه حاصل فعالیت پژوهشی نویسنده در گروه زیست‌شناسی می‌باشد که با حمایت دانشگاه شهید چمران اهواز و با هزینه گرنت سال 98 انجام شده است. این کار حاصل پایان نامه یا طرح نیست بلکه فعالیت پژوهشی درون گروهی محسوب که توسط اعضای هیات علمی انجام می گردد.

1.Akita, S., Hayashida, K., Yoshimoto, H., Fujioka, M., Senju, C., Morooka, S. (2017). Novel application of cultured epithelial autografts (CEA) with expanded mesh skin grafting over an artificial dermis or dermal wound bed preparation. International Journal of Molecular Sciences,19(1); 57.

2.Azizi, M., Ali Roozegar, Jalilian, F., Reza Havasian, M., Panahi, J., Pakzad, I. (2016). Antimicrobial effect of Pistacia atlantica leaf extract. Bioinformation,12(1); 19-21.

3.Aung, S.W., Abu Kasim, N.H., Ramasamy, T.S. (2019). Isolation, expansion, and characterization of wharton's jelly-derived mesenchymal stromal cell: method to identify functional passages for experiments. Methods Mol Biol, 2045; 323-335.

4.Bagheri, T., Fatemi, M.J., Hosseini, S.A., Mousavi, S.J., Araghi, S.h., Niazi, M. (2017). Investigating effect of ghee on treating second-degree burn wound in rats. Tehran University Medical Journal, 75(9); 645-652.

5.Benhassaini, H., El Zerey-Belaskri, A. (2016). Morphological leaf variability in natural populations of Pistacia atlantica Desf. subsp. atlantica along climatic gradient: new features to update Pistacia atlantica subsp. atlantica key. Int J Biometeorol, 60(4); 577-589.

6.Eyarefe, O., Amid, S. (2010). Small bowel wall response to enterotomy closure with polypropylene and polyglactin 910, using simple interrupted suture pattern in rats. International Journal of Animal and Veterinary Advances, 2(3); 72-75.

7.Hassan, W.U., Greiser, U., Wang, W. (2014). Role of adipose-derived stem cells in wound healing. Wound Repair And Regeneration, 22(3); 313-25.

8.Hu, J., Liu, N., Yang, X., Feng, Z., Qi, F. (2014) . Adiposed-derived stem cells seeded on PLCL/P123 eletrospun nanofibrous scaffold enhance wound healing. Biomedical Materials, 9(3); 70408-70420.

9.Hashemi, S.S., Mohammadi, A.A., Kabiri, H., Hashempoor, M.R., Mahmoodi, M., Amini, M. (2019). The healing effect of Wharton's jelly stem cells seeded on biological scaffold in chronic skin ulcers: A randomized clinical trial. J Cosmet Dermatol,18(6); 1961-1967.

10.Hoveizi, E., Tavakol, S. (2019). The rapeutic potential of human mesenchymal stem cells derived beta cell precursors on a nanofibrous scaffold: An approach to treat diabetes mellitus. J. Cell. Physiol., 234(7); 10196-10204.

11.Jaafari-Ashkvandi, Z., Shirazi, S. Y., Rezaeifard, S., Hamedi, A., Erfani, N. (2019). Cytotoxic effects of Pistacia atlantica (Baneh) fruit extract on human kb cancer cell line. Acta Medica (Hradec Kralove),62(1); 30-34.

12.Jing, B., Chen, W., Wang, M., Mao, X., Chen, J., Yu, X. (2019). Traditional tibetan ghee: physicochemical characteristics and fatty acid composition. J Oleo Sci., 4;68(9); 827-835

13.Julius, U. (2003). Influence of plasma free fatty acids on lipoprotein synthesis and diabetic dyslipidemia. [Review]. Exp Clin Endocrinol Diabetes, 111(5); 246-250.

14.Kamolz, L.P., Keck, M., Kasper C. (2014). Wharton's jelly mesenchymal stem cells promote wound healing and tissue regeneration. Stem. Cell. Res. Ther., 5(3); 62.

15.Kim, W.-S., Park, B.-S., Sung, J.-H., Yang, J.-M., Park, S.-B., Kwak, S.-J. (2007). Wound healing effect of adipose-derived stem cells: a critical role of secretory factors on human dermal fibroblasts. Journal of dermatological science, 48(1); 15-24.

16.Liu, P., Deng, Z., Han, S., Liu, T., Wen, N., Lu, W., Jin, Y. (2008). Tissue‐engineered skin containing mesenchymal stem cells improves burn wounds. Artificial organs, 32(12); 925-931.

17.Mahjoub, F., Akhavan Rezayat, K., Yousefi, M., Mohebbi, M., & Salari, R. (2018). Pistacia atlantica Desf. A review of its traditional uses, phytochemicals and pharmacology. [Review]. J Med Life, 11(3); 180-186.

18.Marchini, G., Pedrotti, E., Pedrotti, M., Barbaro, V., Di Iorio, E., Ferrari, S .(2012). Long‐term effectiveness of autologous cultured limbal stem cell grafts in patients with limbal stem cell deficiency due to chemical burns. Clinical & experimental ophthalmology, 40(3); 255-267.

19.Mathers, C. (2008). The global burden of disease: 2004 update. World Health Organization, 177(6); 919-929.

20.Nakagawa, H., Akita, S., Fukui, M., Fujii, T., & Akino, K. (2005). Human mesenchymal stem cells successfully improve skin‐substitute wound healing. British Journal of Dermatology, 153(1); 29-36.

21.Masmoei, B., Molazadeh, A., Kouhpayeh, S.A., Lohrasb, M.H., Najafipour, S., Alamdarloo, Y. (2014). The comparison of burn injury (second degree) recovery using silver sulphadiazine ointment 1% and the combination of mastic gum with ghee. Journal of Fasa University of Medical Sciences, 3 (4); 268-274.

22.Naudot, M., Barre, A., Caula, A., Sevestre H., Dakpe S., Mueller A.A. (2020). Co-transplantation of Wharton's jelly mesenchymal stem cell-derived osteoblasts with differentiated endothelial cells does not stimulate blood vessel and osteoid formation in nude mice models. J Tissue Eng Regen Med, 14(2); 257-271.

23.Nazempour, M., Mehrabani D., Mehdinavaz-Aghdam, R., Hashemi, S.S., Derakhshanfar, A., Zare, S. (2019). The effect of allogenic human Wharton's jelly stem cells seeded onto acellular dermal matrix in healing of rat burn wounds. J Cosmet Dermatol, doi: 10.1111/jocd.13109.

24.Obradovic, H., Krstic J., Trivanovic D., Mojsilovic S., Okic I., Kukolj T. (2019). Improving stemness and functional features of mesenchymal stem cells from Wharton's jelly of a human umbilical cord by mimicking the native, low oxygen stem cell niche. Placenta, 82; 25-34.

25.Peck, M. D. (2011). Epidemiology of burns throughout the world. Part I: Distribution and risk factors. Burns, 37(7); 1087-1100.

26.Pezeshki‐Modaress, M., Rajabi‐Zeleti, S., Zandi, M., Mirzadeh, H., Sodeifi, N., Nekookar, A. N. (2014). Cell‐loaded gelatin/chitosan scaffolds fabricated by salt‐leaching/lyophilization for skin tissue engineering: In vitro and in vivo study. Journal of Biomedical Materials Research Part A, 102(11); 3908-3917.

27.Varaa, N., Azandeh S., Khodabandeh Z., Gharravi, A.M. (2019). Wharton's Jelly Mesenchymal stem cell: various protocols for isolation and differentiation of hepatocyte-like cells; narrative review. Iran J Med Sci, 44(6):437-448.

28. Satheesan L., Soundian E., Kumanan V., Kathaperumal K. (2020). Potential of ovine Wharton jelly derived mesenchymal stem cells to transdifferentiate into neuronal phenotype for application in neuroregenerative therapy. Int J Neurosci, (2020);1-8.

29.Shokrgozar, M. A., Fattahi, M., Bonakdar, S., Ragerdi Kashani, I., Majidi, M., Haghighipour, N. (2012). Healing potential of mesenchymal stem cells cultured on a collagen-based scaffold for skin regeneration. Iran Biomed J, 16(2); 68-76.

30.Slavin, J. (1996). The role of cytokines in wound healing. The Journal of Pathology, 178(1); 5-10.

31.Tavakol, S., Azami, M., Khoshzaban, A., Ragerdi Kashani, I., Tavakol, B., Hoveizi, E., & Rezayat Sorkhabadi, S. M. (2013). Effect of laminated hydroxyapatite/gelatin nanocomposite scaffold structure on osteogenesis using unrestricted somatic stem cells in rat. [Research Support, Non-U.S. Gov't]. Cell Biol Int, 37(11), 1181-1189. doi: 10.1002/cbin.10143

32. Tettamanti, G., Grimaldi, A., Rinaldi, L., Arnaboldi, F., Congiu, T., Valvassori, R., & Eguileor, M. (2004). The multifunctional role of fibroblasts during wound healing in Hirudo medicinalis (Annelida, Hirudinea). Biology of the Cell, 96(6), 443-455.

33. Yuan, X.-q., Qiu, G., Liu, X.-j., Liu, S., Wu, Y., Wang, X., & Lu, T. (2012). Fluoxetine promotes remission in acute experimental autoimmune encephalomyelitis in rats. Neuroimmunomodulation, 19(4), 201-208.

34. Zeb, A., & Uddin, I. (2017). The Coadministration of Unoxidized and Oxidized Desi Ghee Ameliorates the Toxic Effects of Thermally Oxidized Ghee in Rabbits. J Nutr Metab, 2017, 4078360-407871.

35. Zohor, A.R., Shamsodini, S. (2004). Comparison of the regenerative effects of Ghee and silversolfodiazin in skin injury. Journal of Zanjan University, 39(10):21-24.

36. Zuliani, T., Saiagh, S., Knol, A.-C., Esbelin, J., & Dréno, B. (2013). Fetal fibroblasts and keratinocytes with immunosuppressive properties for allogeneic cell-based wound therapy. PLoS One, 24;8(7): e70408.