نوع مقاله: مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 گروه میکروبیولوژی دانشکده علوم پایه واحد زنجان، دانشگاه آزاد اسلامی، زنجان، ایران.
2 گروه میکروبیولوژی دانشکده علوم پایه واحد زنجان، دانشگاه آزاد اسلامی، زنجان، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
سوختگی یکی از وخیم ترین وضعیت های پزشکی به شمار می رود و می تواند در کلیه ابعاد جسمی و روانی ایجاد آسیب نماید و تمامی سنین را نیز می تواند در گیر نماید(13). زخم های ناشی از سوختگی محیط مناسبی را برای رشد گونه های مختلف باکتری ها به شمار می روند که عواملی مانند سن، عمق و وسعت سوختگی می تواند بر این عفونت ها تأثیر داشته باشند(33). کنترل و درمان بیماری های عفونی ناشی از میکروارگانیسم ها از مباحث قابل توجه و تأثیرگذار در سلامت و بهداشت هر جامعه است. امروزه به دلیل رشد فزاینده ی میکروب های مقاوم به آنتی بیوتیک های رایج از یک سو و کمبود ترکیبات ضد میکروبی از سوی دیگر، تداوم پژوهشی در زمینه شناسایی ترکیبات ضد میکروبی جدید ضروری است(28). استافیلوکوکوس اورئوس، کوکسی گرم مثبتی است که در نقاط مختلف بدن انسان و حیوانات به صورت میکروفلور طبیعی یافت می شود. این باکتری در شرایط خاص هم چون استرس، بیماری های ویروسی، آسیب های بافتی و عواملی که سبب ضعف در سیستم ایمنی می شود، عامل بیماری های مختلفی مانند عفونتهای پوستی، مسمومیت های غذایی، شوک های مخاطره آمیز و اختلالات ناشی از خود ایمنی است(8). در طب سنتی نیز تلاش های گوناگونی برای یافتن دارویی در جهت تسریع در بهبود زخم و ضایعات پوستی انجام گرفته است ولی به علت عدم معرفی یک داروی قطعی برای افزایش سرعت روند ترمیم زخم، مطالعات روی داروهای گیاهی و تاثیر آن بر روند ترمیم زخم هم چنان ادامه دارد(14).گزنه(Urtica dioica L.) گیاه گلدار چند ساله ی علفی است که در سراسر جهان رشد میکند(11). این گیاه متعلق به خانواده Urticaceae بوده و به دلیل آن که منبع مناسب از مواد معدنی(آهن، منگنز، پتاسیم، کلسیم)، کلروفیل، اسیدهای آمینه، کاروتنوئید، ویتامین ها و نیز فلاونوئیدها، تانن ها، استرول ها، پلی ساکاریدها ولکتین است به عنوان یک گیاه دارویی مهم در رژیم غذایی انسان توصیه می شود(12). در میان گونههای گزنه، U. dioica و U. urens در حال حاضر شناخته شده تر بوده و به همین دلیل برای مدت طولانی به عنوان گیاهان دارویی در بسیاری از نقاط جهان مورد استفاده قرار گرفته اند(17). گزارش های مختلف نشان داده اند که استفاده از گزنه (دانه و برگ) همراه یا بدونه گیاهان دیگر، دارای اثرات مفید در درمان برخی از بیماری های مانند دیابت، اگزما، التهاب کبد، کم خونی، روماتیسم و سرطان پروستات بوده است(2). برگ های این گیاه برای درمان پرفشاری خون و آرتریت روماتوئیدها، اسیدهای فنلی و ترپن ها در گیاهان، نه تنها اثرات مضر و آسیب شناختی حاصل از رادیکال های آزاد را معکوس می کنند، بلکه در ایجاد فعالیت ضد میکروبی گیاهان، نقش موثری دارند(18). بابا آدم با نام علمی Arctium lappa از تیره کاسنی(مرکبیان) خانواده Asteraceae گیاهی است علفی، دو ساله، دارای ساقه ضخیم منشعب که به حالت وحشی و خودرو در دشت ها و نواحی مرطوب و سایه دار در نواحی معتدل اروپا و آسیا رشد می کند. این گیاه دارای ریشه ای دراز به قطر انگشت با ظاهری دوکی شکل و شیارهای طولی عمیق که به رنگ قهوه ای ولی در مقطع سفید رنگ میباشد(37).ترکیبات شیمیایی ریشه بابا آدم دارای ماده ای به نام اینولین، روغن فرار، رزین، قند، آهن، کلسیم، کوئرستین، آرکتیژنین و ویتامین C می باشد. دانه بابا آدم دارای روغنی به رنگ زرد و طعم تلخ اسیدلینولئیک و اسید اولئیک است(32، 21).گیاه بلاغ اوتیWater cress(Nasturtium officinalis) از تیره شبدر است. موطن اصلی آن در اروپای مرکزی و غربی بوده، اما امروزه در تمامی دنیا گسترده شده است. این گیاه در کنار جویبارها و به طور عمده در مجاورت آب های زلال جاری می روید(32). علف چشمه دارای آهن، ید، منگنز، کلسیم، همچنین یک گلوکز یددار و محلول در آب به نام گلوکوناستورتین(Gluconostrurtine) یا ایزو سولفو سیانو اتیل بنزن است، به علاوه به مقدار زیاد دارای ویتامین های A، C و ویتامین D به مقدار کمتر می باشد(29، 5). سیلور سولفادیازین(SSD: Silver sulfadiazine) یک عامل ضد میکروبی رایج برای کنترل ازدیاد باکتری ها و جلوگیری از عفونت زخم ها به حساب می آید نیز به‌عنوان یک داروی ضدعفونی‌کننده بوده که در موارد پیشگیری و درمان عفونت در سوختگی‌های درجه ۲ و ۳ استفاده می‌شود. سولفامیدها فقط از رشد میکروارگانیسم‌هایی که اسید فولیک را تولید می‌نمایند، جلوگیری می‌کنند و بر سلول‌های میزبان، مثلاً انسان که ماده فوق را از محیط(غذا) دریافت می‌نماید مؤثر نمی‌باشند با این وجود این دارو به عنوان یک روش درمانی در بهبود آسیبهای عمقی و نیمه عمقی استفاده می شود(30، 19). باکتری استافیلوکوکوس اورئوس، کروی شکل و با قطر 1 میکرون بدون حرکت و فاقد اسپور به شکل خوشه انگوری بوده(22) و یکی از مهم ترین عوامل ایجاد عفونت های بیمارستانی است(24). این باکتری باعث ایجاد برخی بیماری های پوستی از جمله: سندروم شوک سمی، کورک، کفگیرک، اندوکاردیت، استئومیلیت و دمل می شود(20) از جمله معضلات شایع در دنیای پزشکی مسئله مقاومت باکتری ها در برابر آنتی بیوتیکها است، استافیلوکوکوس اورئوس نیز از جمله باکتری های مقاوم در برابر آنتی بیوتیک ها می باشد. مقاومت آنتی بیوتیکی در این باکتری از طریق کروموزوم و پلاسمید کنترل می شود(25). مطالعات چندی آثار سایتوتوکسیک این عامل بر فیبربلاست ها و کراتینوسایت ها در محیط in vitro و تأثیر در به تأخیر انداختن ترمیم زخم در محیط in vivo را گزارش کرده اند با وجود آن که مصرف موضعی این دارو در درمان زخم ها بسیار شایع است، اطلاعات کافی در مورد اثر این عامل روی زخم های برشی حاصل از جراحی موجود نیست(15، 7). از این جهت تحقیق در خصوص ترکیبات ضد میکروبی تازه با کمترین زمان و اثرات جانبی کاری ضروری می باشد. لذا مطالعه ی اثر آنتی باکتریالی عصاره گیاهان مذکور بر باکتری استافیلوکوکوس اورئوس در شرایط in vitro و مدل حیوانی الزامی به نظر می رسد. هدف از این مطالعه و تحقیق، بررسی اثر آنتی باکتریالی عصاره های گزنه، بلاغ اوتی و ریشه باباآدم بر روی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس است که درمواقع مثبت بودن و آزمایش های مورد نیاز و تأییدی می توان از گیاهان ذکر شده به جای آنتی بیوتیک ها مورد استفاده قرار گیرد.
مواد وروش ها
تهیه سویه میکروب
سویه باکتری استافیلوکوکوس اورئوس ATCC292113 از بانک میکروبی مرکز تحقیقات بیولوژیکی دانشگاه آزاد واحد زنجان تهیه شد. این باکتری کاملاً بیماری زا و روی محیط های کشت نوترینت آگار کشت مجدد داده و در آزمایش مورد استفاده قرار گرفت.
حیوانات آزمایشگاهی
دراین مطالعه از 25 موش سوری ماده بالغ 8-6 هفتهای با وزن تقریبی 5±25 گرم که باردار و شیرده نبودند استفاده شد. موش ها پس از تهیه از دانشکده علوم پزشکی زنجان به اتاق حیوانات مرکز تحقیقات بیولوژی دانشگاه آزاد اسلامی واحد زنجان منتقل و به منظور سازگاری با شرایط جدید آزمایشگاهی به مدت 4-2 روز نگهداری شدند. در طی مطالعه، موش ها با آب و غذای استاندارد و کافی، تغذیه و در شرایط متعارف آزمایشگاهی شامل 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی، دمای 2±24 سانتی گراد و رطوبت حدود 52 درصد نگهداری شدند(36). پروتکل این تحقیق بر اساس قوانین بین المللی در مورد حیوانات آزمایشگاهی با کد اخلاق IR.IAU.ZANJANREC.1396, 12 انجام و در کمیته اخلاق دانشگاه به تصویب رسید.
تهیه عصاره
در این پژوهش پس از جمع آوری و شناسایی و خشک نمودن گیاهان مورد نظر(گزنه ، بلاغ اوتی و ریشه باباآدم)، 100 گرم از نمونه ها آسیاب و توزین گردید.پودر حاصله در یک باcc200 اتانول 98% غوطه ور وبه مدت 48 ساعت در دمای 4 سانتی گراد نگهداری شد. بعد از 48 ساعت مخلوط های مذکور با گاز استریل 4 لایه صاف و با دور 2500 دور به مدت 4دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ انجام شد. عصاره صاف شده در دستگاه تقطیر در خلا تغلیظ و در لوله استریل ریخته و عصاره تا میزان شیره ای شدن cc10 تغلیظ گردید. پس از عبور از فیلتر غشایی 45/. میکرون و در دمای 4- درجه سانتی گراد نگهداری گردید(6).
تعیین حداقل غلظت مهار کننده از رشد(MIC) و حدافل غلظت ممانعت کننده از رشد(MBC) عصاره ها بر روی استافیلوکوکوس اورئوس
برای هر کدام از عصاره های گیاهان 11 لوله به صورت جداگانه قرار داده شد. سوسپانسیون باکتری استافیلوکوکوس اورئوس با غلظت نهایی 106×5/1 (CFU/ml) تهیه و به لوله ها همراه با محیط مولر هینتون براث اضافه و بعد از رقت سازی عصاره ها به مدت 24 ساعت در انکوباتور گذاشته شد و بعد از زمان مقرر از هر لوله روی محیط کشت نوترینت آگار کشت داده و بعد از گرما گذاری در دمای 37 درجه سیلیسیوس به مدت 18 تا 24 ساعت، کمترین غلظتی از عصاره ها که باکتری در آن رشد نکرده بود به عنوان غلظت کشندگی مورد مطالعه قرار گرفت(31).
بررسی اثر ضد میکروبی و التیام بخشی عفونت ناشی ازسوختگی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس در مدل حیوانی
برای تهیه پماد حاوی عصاره جهت تیمار موش ها، مقدارعصاره های گیاهی برابر با غلظت MBCآنها در هر گرم از پماد آنتی بیوتیک سیلورسولفادیازین اضافه گردید. پس از توزین، حیوانات با استفاده از تیوپنتال 40 میلی گرم بر کیلو گرم به روش داخل صفاقی بیهوش و جهت ایجاد سوختگی درجه 2 سانتی گراد، ابتدا موهای ناحیه پشت گردن موش ها کاملاً تراشیده، سپس به وسیله سکه گداخته شده توسط حرارت به مدت 3-4 ثانیه در محل تراشیدگی قرار داده شد. حیوانات پس از به هوش آمدن در قفسه های انفرادی کاملاً تمیز و ضد عفونی شده نگهداری شدند(31). پس از 24 ساعت استراحت دادن به حیوانات، محل سوختگی با تلقیح سوسپانسیون استافیلوکوکوس اورئوس برابر با کدورت 2 مک فارلند عفونی سازی و از روز بعد درمان برای گروه های مربوطه به مدت 3 روز(روزی 3مرتبه و هر بار برابر 5/0 گرم از پماد) شروع شد(25). در روز چهارم بعد از شروع درمان، جهت شمارش تعداد باکتری مورد نظر در زخم، با استفاده از سوآپ استریل از روی زخم نمونه برداری انجام گرفت و سوآپ ها در داخل لوله های حاوی 5 میلی لیتر تریپتی کیس سوی براث به مدت 2 ساعت در انکوباتور 37 درجه سیلیسیوس نگهداری شدند. سپس از هر لوله روی پلیت حاوی محیط برد پارکر کشت و برای 24 ساعت در انکوباتور 37 درجه سیلیسیوس قرار داده شد و تعداد کلنی های رشد یافته بر روی محیط مورد بررسی و شمارش قرار گرفت(25).
آزمون آماری
نتایج حاصل از کشت باکتری ها در حیوانات آلوده گزارش شد و بررسی اختلاف معنی دار بین نتایج گروههای حیوانی با آزمون LSD وANOVA One way در سظح معنی دار 01/0>P انجام گرفت.
نتایج
نتایج تعیین حداقل غلظت کشندگی و حداقل غلظت مهار رشد برای عصاره های تهیه شده
بر اساس نتایج حاصله از بررسی های MIC و MBC عصاره های آبی و الکلی باباآدم، بلاغ اوتی و گزنه علیه استافیلوکوکوس اورئوس مشخص شد، سپس با وزن خشک به دست آمده از عصاره ها مشخص گردید عصاره آبی ریشه باباآدم و عصاره اتانولی گزنه به ترتیب دارای خاصیت باکتری کشی قوی هستند(جدول 1).
نتایج حیوانی
با توجه به رشد کلنی های باکتری استافیلوکوکوس اورئوس در گروه درمانی با آنتی بیوتیک سیلور سولفا دیازیدین در مقایسه با گروه کنترل اختلاف معنی دار دیده شد(01/0p <). در گروه درمانی که حاوی پماد سیلور سولفا دیازیدین به همراه عصاره ها در مقایسه با گروه کنترل دارای اختلاف معنی دار بود(01/0p <). هم چنین نتایج نشان داد در گروه درمانی با آنتی بیوتیک سیلور سولفا دیازیدین در مقایسه با گروه درمانی که حاوی پماد سیلور سولفا دیازیدین به همراه عصاره ها دارای اختلاف معنی داری بود(05/0p<)(جدول شماره 2). اثرات التیام بخشی عصاره های گیاه هان گزنه، بلاغ اوتی و ریشه باباآدم در این تحقیق به صورت کیفی در مقایسه سرعت التیام زخم های سوختگی ایجاد شده در موش های گروه دریافت کننده پماد و گروه های دریافت کننده پماد سیلورسولفادیازیدین و بدون دریافت درمان انجام گرفته است که لازم به ذکر می باشد گروه دریافت کننده پماد گیاهی به همراه سیلورسولفادیازیدین در عرض 6 روز التیام کامل پیدا کردند، درصورتی که گروه دریافت کننده پماد سیلورسولفادیازیدین در طول 10 روز و گروه بدون درمان در عرض 21 روز بهبود پیدا کردند. در ضمن 2 موش از 5 موش گروه بدون درمان در اثر تشدید عفونت مردند.
بحث و نتیجه گیری
در طی سالیان متمادی داروهای طبیعی به خصوص گیاهان دارویی اساس و حتی در برخی موارد تنها وسیله درمان محسوب می شوند. از آن جا که استفاده از داروهای گیاهی دیدگاهی است که امروزه در درمان و حفظ سلامتی تاکید بسیار بر آن است و از طرفی بسیاری از گیاهانی که در طب سنتی استفاده می شود، بومی هستند، بررسی هایی در میزان اثر بخشی گیاهان دارویی روی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس در نقاط مختلف جهان صورت گرفته است(9). در طب سنتی، استفاده از گیاهان دارویی برای بهبود و درمان ضایعات پوستی می باشد(23). یکی از دلایل مهم تمایل جوامع پزشکی به استفاده از ترکیبات گیاهی عوارض جانبی پایین آن ها نسبت به داروهای شیمیایی بوده که طی سال ها مصرف در طب سنتی به اثبات رسیده است(1). همان طور که سازمان بهداشت جهانی در مورد استفاده بی رویه از آنتی بیوتیک های رایج هشدار داده و نگرانی های جدی در رابطه با افزایش مقاومت در میکروارگانیسم های بیماری زا به وجود آمده است، تحقیقات در زمینه کشف مواد ضد میکروبی مؤثر بر روی این میکروارگانیسم های مقاوم به طور جدی آغاز شده است(4).
جدول1- اثر عصاره های گزنه ،بلاغ اوتی وریشه باباآدم بر روی باکتری استافیلوکوکوس ائوروس
|
MIC |
MBC |
عصاره ها |
|
µg/ml88/546 |
µg/ml75/1093 |
ریشه بابا آدم |
|
µg/ml5/437 |
µg/ml875 |
بلاغ اوتی |
|
µg/ml5/687 |
µg/ml1375 |
گزنه |
جدول2- اثر تیمار های مختلف بر میانگین و انحراف معیار تعداد کلنی های رشد یافته بر روی زخم ناشی سوختگی در مدل حیوانی
|
میانگین |
نام گروه |
ردیف |
|
103×2/112 |
درمان با پماد حاوی عصاره ها و سیلورسولفادیازیدین |
گروه اول |
|
103×166 |
درمان با پماد سیلورسولفادیازیدین |
گروه دوم |
|
104 ×261 |
کنترل و بدون درمان |
گروه سوم |
نشان دهنده اختلاف معنی دار با گروه های سوم(کنترل و بدون درمان) می باشد(01/0p <).
تاکنون گزارشات متعددی در مورد فعالیت ضد میکروبی ترکیبات گیاهی منتشر شده است. ترکیباتی نظیر پلی فنل ها، آلکالوئیدها، ترپن ها و کومارین ها نقش مهمی در تأثیر عصاره گیاهان بر رشد میکروارگانیسم ها دارند(35). عصاره برگ گزنه، در غلظت های پایینتری نسبت به باکتری های دیگر، باعث مهار و نابودی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس می شود که با نتایج حاصل از تحقیقات انجام شده به وسیله رامتین و همکاران(34) و امینی و همکارانش(3) که روی عصارهی گیاه گزنه صورت گرفته است، هم خوانی دارد.در پژوهش حاضر عصاره های گیاهان(گزنه، بلاغ اوتی و باباآدم) با داشتن ترکیبات شیمیایی از قبیل تانن به استوفنون، اسید اسکوربیک، منیزیم، اینولین، روغن فرار، رزین، گلوکو ناستورتین (Gluconustrurtine) یا ایزو سولفو سیانو اتیل بنزن در این گیاهان به عنوان مواد دارویی گیاه تأثیر مثبتی بر روند ترمیم زخم نشان داد و هم چنین وجود تانن در گیاهان که خاصیت ضد باکتریایی دارد. در روند التیام پوست عوامل متعددی می توانند، مداخله نمایند. اسید هیالورونیک به عنوان ترکیبی است که پوست با جذب آن قادر است روند التیام خود را تسریع نماید اسید هیالورونیک یکی از اعضای اصلی زنجیره گلیکوزآمینوگلیکان موجود در پوست می باشد. از دیگر عوامل ملتهب کننده در ضایعات پوستی می توان به سایتوکاین های TNF-α، IL-12، INF-δ و IL-17 اشاره نمود که در روند التهاب مؤثرند. یکی از عواملی که ممکن است اثرات ضد میکروبی عصاره یک گیاه را تحت تاثیر قرار دهد روش عصاره گیری و نوع حلال مورد استفاده می باشد. عصاره هایی که با روشها و حلال های متفاوت از یک گیاه استخراج می شوند می توانند اثرات ضد میکروبی متفاوتی را بر روی یک گونه خاص از میکروارگانیسم ها نشان دهد(27). هدف از این مطالعه بررسی اثر ضد میکروبی و التیام بخشی عصاره های گزنه، بلاغ اوتی، ریشه باباآدم به همراه سیلور سولفا دیازیدین بروی عفونت ناشی ازسوختگی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس درموش بود. طبق نظر باسری(Basri) و فن(Fan) عصاره های گیاهی معمولاً بیشتر در برابر باکتری های گرم مثبت فعال هستند تا باکتری های گرم منفی از این رو در بررسی انجام شده توسط فیسگین و همکاران(2009) بر روی داروی گیاهی با ترکیب گزنه و چندین گونه گیاهی دیگر مشخص شده است که اثر سینرژیسمی این ترکیب گیاهی در حد قابل توجهی باعث کنترل باکتری های گرم منفی شده است(10). هم چنین در تحقیقی دیگر نشان داده شده که عصاره الکلی گیاه گزنه بر روی باکتری استرپتوکوکوس با سویه پیوژنس، باکتری های استافیلوکوکوس اورئوس و استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس اثر ضد باتریایی خوبی داشته است(16).نتایج سینرژیسمی نیز نشان داد که عصاره اتانولی این گیاهان حتی در غلظت های بسیار پایین اثر ممانعت از رشد خوبی را دارا می باشد. در مقایسه با بررسی هایی که در مورد گیاهان موثر علیه استافیلوکوکوس اورئوس در کشورهای دیگر صورت گرفته است و تعیین MIC این گیاهان نشان می دهد که گیاهان مورد بررسی در این مطالعه اثر بسیار خوبی علیه سویه استافیلوکوکوس اورئوس دارند. به طوری که تحقیقات انجام شده در نیجریه روی 6 گونه از گیاهان دارویی آن منطقه نشان داد 4 گونه که به طور معمول به وسیله گیاه پزشکان در درمان عفونت های پوست و عفونت های دستگاه تنفسی استفاده می شود، بر علیه سویه استافیلوکوکوس اورئوس موثرند(26). نتایج آزمون های آماری نیز خود بیانگر آن است که اثر ضد باکتریایی این گیاهان در مقادیر ثابت اختلاف معنی داری باهم دارند. بنابراین بر اساس مطالعات حاضر عصاره های سه گیاه گزنه، بلاغ اوتی و ریشه باباآدم به همراه سیلور سولفا دیازیدین 1 % فعالیت ضد میکروبی و التیام بخشی قابل توجهی بر روی عفونت ناشی ازسوختگی با باکتری استافیلوکوکوس اورئوس در موش دارد.در مجموع نتایج این بررسی نشان داده عصاره های آبی و اتانولی استخراج شده از این گیاهان دارویی(گزنه، بلاغ اوتی و بابا آدم) در شرایط آزمایشگاهی دارای فعالیت ضد میکروبی و باکتری کشی علیه رشد باکتری استافیلوکوکوس اورئوس میباشد.
تشکر و قدردانی
بدین وسیله از مرکز تحقیقات دانشگاه آزاد اسلامی زنجان که در انجام آزمایش ها ما را یاری نموده اند، صمیمانه قدر دانی می شود.
)